WesternBlot试验步骤及关键分析

1、【分享】个人整理 Western Blot ! ! !1、丙烯酰胺和N , N'-业甲双丙烯酰胺，应以温热(以利丁溶解双丙稀酰胺) 的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1 %(w/v)N , N'-业甲双丙烯酰胺储存液 丙稀酰胺29g, N , N-业甲义双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。)储丁棕色瓶，4 C 避光保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化 的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、 十二烷基硫酸钠 SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS, 1mlH2。去离子水配制， 室温保存。3、分离胶缓

2、冲液：1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。4、 浓缩胶缓冲液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶丁40mlH2O 中， 用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。 这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铉形成自由基而加速两种丙稀 酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。AP提供两种丙稀

3、酰胺聚合所必须 的自由基。去离子水配制数 ml,临用前配制.6. 10%过硫酸铉溶液：称取1g过硫酸铉，加超纯水溶解并定容至10ml,分装到1.5ml微量离心管中，冻存。7、SDS-PAGE加样缓冲液：在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul, 总蛋白量100厚8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：30.3gTris, 188g甘氨酸，10gSDS,用蒸僻水溶 解至1000ml,临用前稀释10倍。PH8.39、 转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS(可不加)，200ml 甲醇(临用前加)，加水至总量1L。10、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g三氯乙酸30g

4、磺基水杨酸30g加水 至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。11、脱脂奶粉5%(w/v)。12、 NaN3 0.02%叠氮钠(有蠹，戴手套操作)，溶丁磷酸缓冲盐溶液(PBS)。4.2.4 22.聚丙烯酰胺凝胶溶液:分离胶 12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml超纯水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 mlpH8.8、1.5mol/LTris 溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 mlTEMED 0.002ml 0.004 ml

5、 0.006 ml10%过硫酸铉 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml浓缩胶：5% , pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml超纯水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml30%丙烯酰胺溶液 0.3 ml 0.6 ml 1.0 mlpH6.8、1.0mol/LTris 溶液 0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml10%SDS 0.02 ml 0.04 ml 0.06 mlTEMED 0.002 ml 0.004 ml 0.006 ml10%过硫酸铉 0.02ml 0.04ml 0.06ml一. 配胶1. 注意一定要将玻璃板洗净，最后用 ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下 倾斜

6、置于十净的纸巾晾十。2. 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4C,可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的 热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.70.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可 用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000,浓缩胶用0.8: 1000）即可3. 封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度 <10%时可用0.1%的SDS 封，浓度10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用 0

7、.1%的SDS。封胶后切 记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量活水及 ddH2O冲洗十 净，然后加少量0.1%的SDS,目的是通过降低张力活除残留水滴。4. 灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用 0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正 ；若变形严重，可 在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。二. 样品处理1. 培养的细胞（定性）：去培养液后用温的PBS冲洗2

8、3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。对于6孔板来说每孔加200300心6080C的1 loading buffer0（3） 100 C, 1min。用细胞刮刮下细胞后在 EP管中煮沸10min,期间vortex 23次。用十净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0C后在1400016000g离心2min,再次挑丝。若无团块 也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用 1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞 度，便于上样。待样品恢复到室温后上样。2. 培养的细胞（定量）：去培养液后用温的PBS冲洗23遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。加入适量的冰预冷的裂解液后置于

9、冰上 1020min。（3）用细胞刮刮下细胞，收集在 EP管后超声（100200w）3s, 2次。 12000g 离心，4C, 2min。取少量上活进行定量。将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上 样最好，剩余溶液（溶于1 loading buffer）可以低温储存，-70 C一个月，-20 C一周， 4C 12天，每次上样前98C, 3min。3. 组织：匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50100mg加1ml裂解液，肺100200mg 加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 12000g 离心，4C, 2min。取少量上活进行定量。

10、将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样 最好，剩余溶液（溶丁 1 Xloading buffer）可以低温储存,-70 C一个月，-20 C一周， 4C 12天，每次上样前98C, 3min。三. 电泳1. 上样前将胶板下的气泡赶走。2. 所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1 Xoading buffer上样，Marker也用1 xloading buffer调整至与样品等体积。2. 以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达 65V时改为稳 压电泳。3. 在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。四. 转膜1. 电泳结束前2

11、0分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris 3.0g , Gly 14.4g , M-OH 200ml ,加去离子水 至1,000ml。干转则取此转移液，每 50ml加入10%SDS180ul。浸泡NC膜：将NC膜平铺丁去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸 入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。2. 取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴 趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置丁洁净玻璃板上，按顺序 铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。

12、注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的 过多部分（尤其是干转，以防止短路）3. 转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺丁海绵 上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。 降 温，将电泳槽置丁冰水混合物中。包流 100mA过夜，或400mA , 4h。注意不 同蛋白的要求不同。干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以 1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。五. 封闭及杂交1. 封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与 PBST或TTBS稍加漂洗，浸没丁封闭 液中缓慢摇荡一小时。必要

13、时可先用丽春红染色（2%乙酸,0.5%丽春红的水溶液） 观察蛋白条带，再用去离子水和 TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白 marker 则可省略此步。2. 结合一抗：一抗的准备：使用反贴法时每张 3>9cm2膜约需2ml 一抗稀释液。反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加丁摇床的塑料膜上，将 Western膜从 封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4 C静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平也以防止液体 过多蒸发。3. 洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次 5-10min。4. 结合二抗：根据一抗来源选择合适的二

14、抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体， 按相应比例稀释（1:10001:10000）,室温轻摇一小时。5. 洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次 5-10min。六. 发光鉴定一般使用辣根过氧化物酶 HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶 AP-NBT/BICP显 色法。1.HRP-ECL 发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干， 反贴法覆丁 A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴 角吸干，置丁保鲜膜内固定丁片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光 强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中 1-2mi

15、n ,活水漂洗一下后放在定影 液中至底片完全定影，活水冲净晾干，标定 Marker,进行分析与扫描。2. AP-NBT/BICP 显色法：每片NBT/BICP可溶解丁 30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中, 每张3 X9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子 水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆丁NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现 时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。七. 增强敏感性若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：1. 用活水漂洗膜数分

16、钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。2. 将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。3. 封闭 4060min4. 一抗杂交，室温1h。37C 1h会更强,但可能增加非特异条带。5. PBST或TTBS洗膜20min ,期间换2次液。6. 二抗杂交，37 C 1h。7. PBST或TTBS洗膜20min ,期间换2次液。8. 发光鉴定。9. 若条带仍未出现或很淡，可以再用 PBST或TTBS洗涤膜20min ,期间 换2次液。10. 三抗杂交，室温1h。37C 1h会更强，但可能增加非特异条带。三抗即 抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等

17、。11. PBST或TTBS洗涤膜20min,期间换2次液。12. 发光鉴定。八. NC膜的多次使用一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与七.增强敏感性”相近。1. 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用 PBST洗涤掉发光液(10min彳次)后从一抗杂交开始，后续步骤同前。2. 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液(可用杂交袋)丁室温摇动洗涤30min60min，然后用PBST洗 涤10min沁次，布从封闭开始，后续步骤同前。3. 对丁杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度 更强的自配的str

18、ip液(可用杂交袋)丁 50 C洗涤30min，然后用PBST洗涤 10min沁次，再从封闭开始，后续步骤同前。Western的原理几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽业基并尽可能减少其相互问的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样丁电 泳凝胶上。变性的多肽与 SDS结合并因此而带负电荷，由丁多肽结合 SDS的 量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此 SDS多肽复合物在聚 丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的

19、标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液 的pH值与离子强度不同丁配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移 动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的 SDS多肽复合物向前推进。样品通过 高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。曲丁不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩丁极小体积的能力， 故大大提高了 SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8),上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离 胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有 0.1

20、%的SDS(Laemmli,1970), 样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边 界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处 pH值较高，有利丁甘氨酸的离子化， 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶， 并被筛分而依各自的大小得到分离。电泳丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯 化效果。这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模， 因为随着胶厚度的增加，电泳时

21、的热效应会严重干扰蛋白的泳动。Western bloting首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲 液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用 重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带 到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方 法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹 可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和 NC膜夹成 兰明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的

22、缓冲液中进行电泳，选 择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用丁固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一 种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快（15-45分钟）。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用丁对蛋白质的进一步检测。印迹首 先用蛋白溶液（如10%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水 结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体 （一

23、抗）处理，印迹中只有待研究的蛋 白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样活洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。 处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结 合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连 的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成 有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶

24、连抗 体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。碱性磷酸酶可以 将无色的底物5-漠-4-氯呵噪磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶 可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔哇氧化成褐色产物或将 4-氯蔡酚氧化 成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照 相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性 标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。在Western

25、bloting实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物 显色。这种方法叫直接法，与用二抗的间接法相比有诸多不足， 标记二抗可用丁 很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止 一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都采用间接法进行检测。Western bloting要注意的一些问题1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如3-actin, GAPDH）或阳性血活）;阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血活（即正常血）;空白对照（不加一抗，用PBS代替）;无关对照（用无关抗体）2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体

26、说明书选择最适当的比例，一抗二抗 的选择直接影响实验结果以及背景3、实验设计时所采用的抗原批次要一样， 尽量的避免人为的带来个体差异 特别在做裂解液时更要注意所采用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带 来不确定性。4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没 有气泡;积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致 胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时兰明治” 的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴 为宜。6、封闭时一般在室温下 2h就够了，但是要注

27、意如果是生物素标记的二抗 就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用 BSA效果更好。7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净, 有利丁降低背景；容易忽视的问题主要在丁过硫酸铉 （AP） 一定要新鲜一一最好用小指管配 AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多 次的AP都别用四. 上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个 条带都弯弯地 笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多 重复使用电泳Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的）。当预染的Marker 告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳

28、分辨区 一一分离胶的2/3处，OK,电泳 结束了。电泳结果检查：如果要做 Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先 看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨 1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。可是由丁考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步 同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般 也可以说明问题。所以最经济实惠的方法是：丽春红 S,直接染色转移膜，检测 转膜效果，充分脱色后不干扰 Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮 蓝差不多。转膜：经过P

29、AGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过转膜”步骤一一从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes , NC）和PVDF膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做 蛋白印迹。选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面 积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）;b.不影响后 续的显色检测（也就是适和用丁所选的显色方

30、法，信噪比好）;c.如果后继实验有其 他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析， 还要根据不同目的来挑选不同的转移 膜。NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低较局低结合能力 80-110 ug/cm2 >400 ug/cm2 125-200 ug/cm2（ 适合丁 SDS 存在 下与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿，避免气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿检测方式 常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料 常规染色，比较丁 NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用丁 ECL检测，快速免疫检测。适用范围0.45um 一般蛋白0

31、.2um 一分子量小丁 20kD蛋白0.1um 一分子量小丁 7kD蛋白 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋 白多糖（主要用在核酸检测中）糖蛋白检测和蛋白质测序价格价格较便宜便宜较贵1. 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能 力，而且适用丁各种显色方法，包括同位素，化学发光 （Luminol类）、常规显色、 染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预 处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了;比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的活洗条件。转移到 NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保

32、存很长时间， 不过要注意的是纯的硝纤膜在比 较脆，乂容易卷，操作要小心，不适合用丁需要多次重复活洗的用途 一一因为经 不起多次折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小丁 20KD的话建议选择0.2um的，如果小 丁 7KD的话最好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的 NC膜混有含醋 酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由丁 NC膜上结合的 蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20 ,而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。一般而言，NC膜越纯，其蛋白 结合能力就越高，所

33、以要增加 WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是 个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素 这在前面已经提到，会 影响蛋白质结合。Protran由丁是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小 心操作，如果担心自己 粗手粗脚”，那么就可以考虑一下 Optitran或者Pall公 司的以耐受力著称的 BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane 。卷膜肯定 是最实惠的选择，只不过要自己动手裁剪 一一切记，必须带手套操作。2. PVDF 膜与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性 上都更优越的性能。市售硝酸纤维素膜的典

34、型结合量是 80-100四/cm2,而PVDF 膜结合量是100-200 pg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍!）。但是PVDF 膜最大的优点不仅丁此：更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用丁多种目的，特别是需要做 N端蛋白测序，在相当 严酷”的活洗条件下，当尼龙或者硝 纤膜已经降解的情况下 PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以 PVDF也是要 做蛋白测序的唯一选择。但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要 同样程序再处理（不过要

35、真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜 前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢）。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附， 背景可能会比前者稍高。卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交。再次强调的是，疏 水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟， 待膜变成半透明后用纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS-PAGE）A:实际操作1. 做胶前的准备1）检查是否有足够的、干净的 spacer、comb和架子。2）检查是否有新鲜的，足量10%AP

36、S ,没有立刻重配。3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。2. 制胶，电泳1）装好架子。2）配分离胶，在胶上面加入一层蒸僻水，促进胶更好的凝集。3）待分离胶凝集后，配制浓缩胶倒好后插入预先准备好的梳子。4）上样，电泳。 上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。电泳时间在1.5小时左右。B :注意事项及常遇到的问题1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 （载荷面积：如果你的胶槽是5mm刈mm , 则载荷面为：1mm >5mm=5mm2）。3）

37、gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示 TEMED、APS用量过多，此时 胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实 际不纯或失效。4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特 别是甘油。5）电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。条带呈皱眉状，可能是由丁装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底 部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。五. 三、转移在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体

38、 （膜）上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有 NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF 等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及 具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和 Immobilon-PSQ（0.2um for MW<20kDa）。A半干法即将凝胶火层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲 液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比 较严酷，但是其转移时间短，效率高。1实验条件的选择电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓 度选择转

39、移时间目的蛋白分子大小（kDa）胶浓度 转移时间80-140 8% 1.5-2.025-80 10 1.515-40 12 0.75<20 15 0.52实验操作（1）滤纸和膜的准备（在电泳结束前20分钟应开始准备工作）。A. 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。B. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入 transfer buffer中。转移A. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的湿润。B. 将胶剥出，去掉stack gel,小心的移到膜上。C. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。D

40、. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些transfer buffer ,再铺两张靠胶滤纸。E. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。3注意事项及常遇到的问题1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸 >=膜>=胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中， 膜也必须随时保持湿润4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所 以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为1.5小时，（1mA-2mA/cm2 , 10% gel）,可根据

41、分子量 大小调整转移时间和电流大小。B转移后效果的鉴定1. 染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效 果。2. 染膜有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red > Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析 用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色 后膜就不能用丁进一步的分析。四、封闭（block）封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合，我们一般用 non-fat milk在转移结束前配好5%的Mil

42、k（TBST溶解）。转移结束后将膜放入 milk中 block（-定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜），并活洗整理好用 过的滤纸，以便下次使用。 Block 4 C O/N ,或RT 1小时。五、孵育一抗A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。B. 配好5%的Milk（TBST溶解），按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀 释，最好采用梯度稀释。C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。注意：为了便丁后面分析结果,我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度 高的抗体作为marker与一抗同时孵育。六、洗涤用TBST先

43、快速洗三次，把 milk尽快的wash掉。然后5mins *5。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。七、孵育二抗孵育RT1小时。一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗八、洗涤用TBST先快速洗三次，把 milk尽快的wash掉。然后5mins *5。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深 浅，所以洗涤一定要干净。九、显色（HRP酶）1. 增强化学发光法（ECL）Ecl显色原理：鲁米诺在免疫测定中既可用作标记

44、物， 也可用作过氧化物酶 的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用 下，发出荧光来。试验步骤：1）将两种显色底物1: 1等体积混合（一般各1ml/membrane）。2）将混合物覆盖在膜表面,1-2分钟，摇晃使均匀。3）用保鲜膜把膜包起来，放入火板中。4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，火好火子，曝光 1min。5）显影、定影。6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。注意：荧光在一段时间后会越来越弱。记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢蠹害你的身体）1. 如果WB前没有可参考

45、的资料比如不知道是否有表达，比如抗体少 还要摸条件（释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点 时间省点试剂；2. 去掉积层胶后，预染的 Marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面（预染Marker如果照着说明书用量，有可能在电泳时看不到条带，但转膜时有浓缩 效应而且背景白就可以看到了。如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或者多加1 2倍的量）;如果目标蛋白小，指小剂也可以指小方向，但是如果蛋白 大,指示剂已经跑出去了，就要留意分活胶上下方向，切个小角是常用的方法。 膜和滤纸一起裁最好（不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀+尺 子+垫厚报纸划比较容易）尽量和胶

46、一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液 平衡过再量。我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm,保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。3. 对丁特别小的蛋白，tricine SDS-PAGE 电泳有助丁提高蛋白大小在 1KD 20KD问的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的浓度也不用太高（可参考2004 年中国生物工程杂志上有一篇文章（有效分离1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方 法）4. 转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助丁进一步去掉可能有碍转膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。5. 膜漂在水面（或者甲醇液面）让液体从下通过膜上的孔渗上

47、来以赶走膜内空 气，膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志， 会影响转膜的。最后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理PVDF不要超过15秒。以 后的步骤中不要让膜干涸了。6. 电转移缓冲液通常用Tris glycine系统，如果是转膜后有部分样品要蛋白 测序，最好用CAPS缓冲液，减少甘氨酸对测序的污染。7. 半干电转移（Semi-Dry）用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽，非常节约试剂，而且效果也好。由丁不用 泡”在缓冲液中，半干转不单可用均一缓冲 体系，也可以做非均一转移缓冲体系。半干转可以在30分钟内完成转膜（每平方 厘米电流2.53.5mA ,包流，冷库。如果电流要

48、求小可以延长到 6090分钟， 但要防止过热。如果有那种温度贴，可以贴上参考温度），即使205KD这么大的 蛋白转膜效率也高达 80%。各种大小的蛋白的转移效率都OK。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转（面积还是按照单个计算），只要控制好单位面积的电流 强度，防止过热就好了。8. 有人觉得转膜加SDS有助丁大分子蛋白转膜，我个人持保留意见，因为 SDS等去垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合，反而不好。9. 如果只做Western Blot ,膜可以用丽春红S染色并在脱色前照相，对后面的免疫反应影响不大。不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染Marker需要用针或者笔扎眼记录条带位置，

49、以免后面会洗掉而无法判断结果。预染 Marker也有助丁判断转膜的效率和情况，如果比目标分子大的 Marker都已经转过去了，那就 OK 了。10. 有人说在中性条件下电泳有助丁蛋白测序，如果要蛋白测序需要提前一天倒胶，并说预电泳6小时（有还原剂如Glycolate）后再倒积层胶。除了要做HPLC 分析应该用丽春红S而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色，其他的比如测序或者PTH都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。11. 转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带，有时这种快速的方法可以不用染色识别条带，避免染色膜影响后继实验。转膜后的封闭注意：1

50、2. 转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限丁封闭做的好不好。 脱脂奶是最常用的经济配方，用这种封闭剂由 丁里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素一 亲和素的检测方法，脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。如果采用碱性磷 酸酶检测系统，封闭剂最好用 6%酪蛋白+1%聚乙烯毗咯烷酮+10mmol/L EDTA 磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活（可以加0.05%叠氮化钠，新鲜 最好）。经济的脱脂奶配方和 AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也 更宽，现在HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠（NaN3）对辣

51、根过氮化物酶 （HRP）有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记： 封闭时间和封闭剂的量都要足够。13. 如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择 Tris缓冲体系，不要用 PBS，因为PBS干扰AP。这些小孔的孔径随双丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近 1 : 20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按 双丙烯酰胺丙烯酰胺” 为1 : 29配制，试验表明它能分离大小相差只有 3%的蛋白质。分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避 光存放丁 4C,可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热 量会使低温时溶解丁

52、储存液中的气体析出而导致气泡,有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.70.8:100,分离胶浓度越高 AP浓度越低，15%的分离 胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩 胶用 0.8: 1000）胶浓度10%时可用0.1%的SDS封，浓度10%时用水饱和的异丁醇或异 戊醇，也可以用0.1%的SDS）,封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量活水 及ddH2。冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS,目的是通过降低张力活除残留 水滴。两胶板之间的电泳液要满.接好正负极，开始电泳，可先小电压 约50V，大 约跑过浓缩胶后再改为100

53、V.观察MARKER的情况，适时终止电泳.建议说目的带要跑到分离胶的 2/3处比较好，但本人一直都在上1/3处，结果 也还可以.如果浓缩胶跑的好的话，几个孔的蛋白会跑成一条直线.注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔 中加入等量的样品缓冲液未聚合的丙烯酰胺具有神经蠹性，操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时 应确保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小 心，不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避 免针头刺入胶内.10*电泳缓冲液：Tris7.58克，甘氨酸36克，SDS 2.5克，ddH2O定容到 250ML

54、.不好溶，可用搅拌器.可重复使用，每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的，也不麻烦.转膜：跑完电泳后，取出胶，可以一块做考马思亮蓝 R250染色约30分钟，脱色液脱色，看看蛋白条带跑的如何，上样量如何.另一块可用做转膜.放入转移缓冲液中摇30分钟左右（有次着急只晃了 10 分钟，结果也挺好的）。NC膜，0.22um，效果挺好的，MARKER易染上，丽 春红也易着色，还一洗就掉。能比较活楚的了解转膜效果。不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是BIO-RAD的半干转（电压不过25V的那款），电源是BIO-RAD的PC200 ,70KD的我转50分钟，20V , 17KD 的转20V, 30分钟

55、左右，条件不是很稳定，有时半路打开盖子看看MARKER转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用包流，说 1.2-2MA/CM2我 看了一下，我的胶大约都是 5*3左右大的，20V 一般电流会是60-30MA之间， 要是这样算的话，最高就跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有 时候能用个3-4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均 匀度;Buffer 一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用 低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的 更好，特别是对丁高分子量的目的蛋白；1本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近

56、两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。 所以本人的试验结果中出现了小斑点。 建议最好 使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较 好。2本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么 问题，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜， 不要漏掉任何一个小角落哟。3洗膜的时候，最好将膜放在平也中，置丁水平的试验桌面上，不时用手晃 动一下平血，这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。 因为在脱色摇床上晃动，有时 洗涤液不足以完全没过膜，在最后显色的时候，会发现液体流过的一道道痕迹， 使背景值增加。4其实在western blot中，以上操作都是

57、小问题，最主要的是一抗的质量和 待检测蛋白的提取质量。在试验之前，最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检 测（如ELISA）,看看其效价和质量，以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和 加量。另外，在做杂交之前最好也先跑一块PAGE胶，染色，检测一下待检蛋白的提取质量。5在加一抗温育之前，最好先将等量的一抗与野生型（即阴性对照）的蛋白在 37摄氏度作用30分钟，这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。6 一定不要忘记做阴性对照和阳性对照， 特别是阴性对照，不然结果出了什 么问题，就无从分析了。7全程做下来，最后的显色就像是个一锤定音的时刻， 分外激动，但也应该 尤为专注，一旦目的条带出现了，就要马上对显色进行终止，要不然杂带就要出来了。快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液， 甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadingbuffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。另一个感觉是样品中目的蛋白的