基因缺的部分

1、芃3、基因工程中常用的工具酶的主要类型及其功能？羁限制性内切酶主要用于 DNA 分子的特异切割袇 DNA 甲基化酶用于 DNA 分子的甲基化袇核酸连接酶用于 DNA 和 RNA 的连接螂核酸聚合酶用于 DNA 和 RNA 的合成螁核酸酶用于 DNA 和 RNA 的非特异性切割羈核酸末端修饰酶用于 DNA 和 RNA 的末端修饰羆其它酶类 -用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。蒅6、简述入噬菌体溶源性侵染循环的一般过程？蒁三个阶段： 溶原的建立、 保持和噬菌体的释放 第一个阶段是 DNA 整合到宿主染色体上。 成为前噬菌体状态第二个阶段是阻遏白操纵子的表达。其产物cI 蛋白与 cI 基因

2、左、右两边操纵子（即早左操纵子和早右操纵子 ）的操纵基因（0L和OR）结合，抑制它们的转录。羀10、简述鉴定克隆常用的几种方法？肄载体表型选择法袅根据插入基因的表型选择节 DNA 电泳检测法螇核酸杂交检测法蒆11、简述原位菌落杂交 （colony hybridization）法的基本步骤 ?芄是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出 DNA 。将DNA烘干固定于膜上与 32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上 的菌落对位。羂13、 DNA 聚合酶的作用机制。袈1聚合作用：在引物 RNA'-OH 末端，以 dNTP 为底物，按模板 DNA

3、 上的指令由 DNApol I逐个将核苷酸加上去，就是 DNApol I的聚合作用。薅23' t够卜切酶活性 一-对作用：这种酶活性的主要功能是从3't5方向识别和切除不配对的 DNA 生长链末端的核苷酸。蚄35' t吩卜切酶活性除修复作用：5't3外切酶活性就是从 5't3方向水解DNA生长 链前方的 DNA 链，主要产生 5'-脱氧核苷酸。蚃14、 M13 噬菌体作为克隆载体的优点。袀用 M13 作为分子克隆载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒只含单链DNA ，其中包含了克隆 DNA 片段的二条互补链中的一条， 因此可用来作为对 DNA

4、测序的模板。 另卜， 可用来产生单链的 DNA探针以选择和分离互补的 RNA。 M13的RF型是双链DNA，便于 限制酶的识别和切割，克隆进双链的卜源 DNA 。从细菌培养液中大量抽取单链 DNA 。羇17、简述引物设计的原则。膃 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在 1530 碱基之间。 G+C 含量在 40%60% 之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 引物 5'端可以修饰。 引物3'端不可修饰。 引物3 '端要避开密码子的第 3位。蒃19、简述溴乙锭在

5、电泳中的作用。蚇一种嵌入剂 ,用以快速检测琼脂糖凝胶中的核酸分子。将溴乙锭加入琼脂糖凝胶中,电泳中的核酸分子能与它形成核酸溴乙锭复合物,在紫卜灯下呈明亮荧光的条带肆22、某学生在用 EcoRI 切割卜源 DNA 片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因 ?薂(1 )高甘油含量 (>5, vv)； (2)限制性内切核酸酶用量过高 (>100UugDNA) ； (3)低离 子强度 (<25 mmol L) ； (4)高 pH(8.0 以上)；(5)含有有机溶剂，如 DMSO ，乙醇等； (6) 有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+ , Cu2+, C02+ , Zn2+等)罿

6、23、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因可以通过何种方法克隆该基因 ?螈答：可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR 引物从 cDNA 文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从 cDNA 表达文库中筛选相应的克隆膄25、在基因工程中，最常用的两种策略是基因添加和基因敲除，即反义RNA 技术，简述反义 RNA 技术的基本原理。羂利用自然存在的或人工合成的反义RNA ，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组 DNA ，然后转染受体细胞， 则这一反插入的序列就会随细胞周期产生大量反义 RNA ， 对基因的表达进行调控，从而抑制、封闭或破坏靶

7、基因的表达。蚀29、怎样将一个平末端 DNA 片段插入到 EcoR I 限制位点中去螀化学合成一些长为 10bp 含有 EcoRI 识别位点的短的 DNA 片段，然后与待克隆片段两端连 接起来，如果用 EcoRI 切割这种连接片段，就会产生 EcoRI 的单链末端。这种片段就可以 插入到任何 EcoRI 的限制性内切酶位点中。薆 30 、什么是 Western 印迹 ?它与 Southern 印迹有什么不同 ?蚅 Western 印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗 体进行检测。 它与 Southern 的不同在于探针的性质不同， 在 Western 印迹中使

8、用的探针是抗 体（ 蛋白质 ）。莀薇蚅肄 3 、请列举出我们所介绍过的将平末端 DNA 分子转变成为黏末端的方法膀如何将一平末端的 DNA 片段与 BamH I 形成的黏性末端连接？虿将平末端的 DNA 也用 BamH I 酶切， 获得带有 BamH I 黏性末端的 DNA ，将二者混合， 在 DNA 连接酶的作用下，它们的黏性末端互补，彼此退火连接形成环状的重组质粒。羇 5、试述影响 PCR 反应的因素有哪些？薄影响 PCR 的因素主要包括两个大的方面，即反应体系和循环时间。袁 1 、反应体系螀反应体系主要包括六种基本要素，即PCR buffer, Mg2+ , dNTP，引物，模板和酶。肅

9、PCR buffer的作用是给 DNA聚合酶提供一个最合适酶催化反应的条件。PCR buffer的主要缓冲成分是Tris-Hcl，起作用是在实际的 PCR过程中，保持反应体系的Ph在6.8-7.8之间。 PCR buffer 中还有一些物质，例如 KCL ， NaCL， BSA 或明胶或 TWEEN20 及 DTT 等均起 到酶的保护剂的作用。目前Takara公司销售的一般都是 10*PCR Buffer，使用时使得终浓度为 1*PCR Buffer 就行。有些 Buffer 中含有镁离子，有些不含有镁离子，如果是后者在反应 体系中还需要加入适量的镁离子。羃Mg2+在dNTP和核酸骨架之间起到

10、桥梁作用，能够增加PCR的扩增效率。镁离子浓度过高，会降低反应的特异性， 镁离子浓度过低会影响 PCR 产量，甚至是导致 PCR 扩增失败， 研究表明镁离子浓度在 1.5mM-2.5mM 之间效过最佳。蚁dNTP的质量和浓度与 PCR扩增效率有密切的关系，dNTP浓度过高会导致错配，浓度过低会降低产量。 dNTP 的推荐浓度是 20-200umol/L 之间，一般都使用 200umol/L 。薇引物，引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引 物，利用 PCR 就可将模板 DNA

11、 在体外大量扩增。要想获得较优的引物，得遵循很多基本 原则，最基本的是引物的长度， GC 含量及 Tm 值要适中， 不能有引物二聚体， 交叉二聚体， 不能有错配等。设计一个较优的引物关系到 PCR 的成败及产物的特异性。蒈模板，一般人的基因组 DNA模板推荐使用量最高，大概为0.1-1ug,大肠杆菌基因组 DNA 为10ng到100ng，质粒DNA为0.1-10ng。模板量过高会导致非特异片段的出现，相反模板 量过低会降低反应效率。莃酶的浓度过高会导致非特异性条带的产生，酶量过低会降低效率。一般per反应的推荐酶量是 1.5U/50ul 。莂2、循环时间蕿预变性：93-96C，通常是94,模板

12、DNA偏大时，适当升高预变性温度，可设为95C,时间为3-5min，通常为3min , 1个循环，预变性的作用是使模板 DNA的二级结构充分打开， 使得退火过程中引物能够充分结合到模板上；薆变性：93-96C,通常是94, 目的条带偏大时，适当升高预变性温度，可设为95C，时间为5-30S，通常为30s，变性的作用是使目的 DNA的二级结构充分打开，使得退火过程中 引物能够充分结合到已扩增的目的 DNA 上；袂复性：50-72 C,通常根据引物的 Tm值决定，Tm-5 C, 5-90s,通常为30s,过长的退火 时间会增加引物与模板的碰撞几率, 增加非特异性条带的产生, 退火温度过高, 特异性

13、较强, 但是效率不高,退火温度过低特异性降低,效率会升高；膂延伸：68-72 C, 一般为72 C，温度跟酶的最佳活性有关，时间根据扩增的目的片段的 长度而定,一般是 1kb/1min ,如果酶的效率高,可以根据说明书设定；蚀重复构成循环，通常为 25-45个循环，一般为30或35,循环数过多会增加非特异 性条带的产生；蚅补平延伸： 68-72 摄氏度, 通常是 72,5-10min , 1 个循环, 是使产物延伸完整 ,循环中每个 延伸时间虽然从理论上来说已经可以足够延伸完全了,但有的循环可能没有完全达到我们所设计好的要求 ,所以最后一步是为了完全使每个产物都能够完全的延伸蒅终止反应，一般是

14、 4C保温袂 14、试述标志获救的范围与局限性。蒇虽然标志获救可用于获得许多基因，但仍有两方面的局限性。（1）必须要有与待测基因对应的突变株。（2）需要只有野生型才能生长的培养基。标志获救适用于多数编码生物合成酶的基因，因为这些基因的克隆可通过类似用于trpA的方法在基本培养基上筛选出来。这一技术并不局限于大肠杆菌，甚至不局限于细菌；在酵母和丝状真菌的营养缺陷型菌株中，利用标志获救同样可以筛选克隆基因。肇15、说明Sanger DNA测序法的原理。羅核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3 '端的一系列长度不等的核酸