抗体工程期末复习总结--华南农业大学

1、U2抗原1、抗原(antigen)可被T、B淋巴细胞识别，并启动特异性免疫应答的物质。 2、抗原的特性v 免疫原性(immunogenicity)（决定条件：异物性）刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。v 抗原性(antigenicity) 抗原能够与其所诱生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力 。3、完全抗原 ：同时具有免疫原性和抗原性的物质。半抗原(hapten) ：仅具有抗原性而无免疫原性的物质。载体(carrier) ：与半抗原结合而赋予其免疫原性的物质4、抗原决定基(antigenic determinant, AD) 决定抗原特异性的基本结构或化学基团。又称表位(epitope)

2、是抗原与TCR/BCR及抗体特异性结合的基本单位。 抗原特异性的分子基础5、抗原结合价(antigen valence)：一个抗原分子上能与相应抗体分子结合的表位数目6、抗原的交叉反应（cross reaction）由共同表位刺激机体产生的抗体可以和两种以上的抗原结合发生反应。 8、超抗原(superantigen, SAg) * 一类由细菌外毒素和逆转录病毒蛋白构成的抗原，能与多数T细胞结合并为T细胞活化提供信号，极微量蛋白可活化多克隆T细胞，产生很强的刺激效果，故称为超抗原9、丝裂原：可致细胞发生有丝分裂，进而增殖的抗原10、佐剂（adjuvant）某些物质预先或与抗原同时注入体内，可增强

3、机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型亲和层析：将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。亲和力成熟：指在抗体生成过程中，由于体细胞高频突变，抗体分子的平均亲和力逐渐增强。等位排斥: B淋巴细胞中编码抗体的一对等位基因，只有其中一个等位基因表达免疫球蛋白质的特性。人-鼠嵌合抗体:将鼠源单抗的可变区和人抗体的恒定区融合而得到的抗体。DNA疫苗: 这种核酸分子是一种细菌的质粒，在克隆了特异性的基因以后，能在真核细胞中表达蛋白质抗原，刺激机体产生特异性体液和细胞免疫。抗体库 通过PCR技术

4、把抗体基因克隆到原核细胞中，并在在原核系统中功能性表达多样性抗体基因(repertoire)， 通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因的技术。可能会考的中英解释：Fab：抗原结合片段 HVR：超变区 Fc ：可结晶片段 CDR：互补决定区 Ag:抗原 FR：骨架区 Ab:抗体 APC：抗原提呈细胞 Elisa:酶联免疫吸附试验 PcAb：多克隆抗体 McAb:单克隆抗体 DC：树突状细胞 IgG和IgM ：G免疫球蛋白和M免疫球蛋白 （个人看法，也有可能是g重链免疫球蛋白和重链） M：巨噬细胞 Elisa:酶联免疫吸附试验 ScFV：单链抗体2、ELisa的基本原理和种类ELISA是酶联接免

5、疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。种类有:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等。U2免疫学基础1、免疫（immunity）是机体识别“自己”, 排除“异己（非己）”过程中所产生的生物学效应的总和，正常情况下是维持

6、内环境稳定的一种生理性防御功能。2、免疫学（immunology）研究机体免疫系统结构和功能的独立学科。4、免疫系统的功能1.免疫防御（immune defense） 指机体对外来微生物及其毒素的免疫保护作用； 应答过强或持续过长超敏反应； 应答过低或缺如免疫缺陷病。2免疫自稳(immune homeostasis) 免疫系统通过调节网络实现免疫系统功能相对稳定； 自稳机制发生异常（应答过强或过弱）自身免疫病。3. 免疫监视（immune surveillance） 指免疫系统识别畸变和突变细胞并将其清除的功能； 免疫监视功能异常肿瘤发生或持续病毒感染。5、非特异性免疫（nonspecific

7、 immunity）个体在长期进化过程中逐渐形成的防御功能，乃经遗传而获得，而并非针对特定抗原，属天然免疫。 先天具有；无特异性；无记忆性；作用快而弱。* 主要机制 物理屏障 皮肤粘膜/血脑/血胎屏障； 化学屏障 皮肤与粘膜局部分泌抑菌和杀菌物质； 生物学屏障 6、特异性免疫（specific immunity）个体发育过程中接触特定抗原（决定基）而产生。仅针对该特定抗原（决定基）而发生反应。 后天获得；有特异性；有记忆性；作用慢而强。 U3鼠源单克隆抗体1、细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团3、PcAb， Polyclonal antibody：针对多种抗原决定簇的混合抗体McAb ，M

8、onoclonal antibody:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体5、单克隆抗体的鉴定    1杂交瘤细胞染色体的检查  采用秋水仙素裂解法进行。    2单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。    3单抗的特异性鉴定  可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。    4单抗的效价测定&

9、#160; 可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。5 必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。（一）杂交瘤细胞的大量繁殖     克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋

10、巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的1001 000倍。    利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。    1材料（1）经高压灭菌的降植烷。（2）Balb/c鼠：58周龄。（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。（4）RPMI1640培养液（5）新生牛血清2操作方法(1) 于小鼠腹腔注

11、射0.5ml降植烷，注射后周内种植细胞。(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用FCS1640液洗涤一次，1 000r/min离心10min(3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用FCS1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔13天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。6、制备单克隆抗体的基本技术1 抗原提纯与动物免疫2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合4 抗体检测5 杂交瘤的

12、克隆化和冻存6 McAb的制备7 单克隆抗体的纯化7、克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法筛选阳性克隆常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术8、单抗纯化方法:l 盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 辛酸沉淀法9、 单克隆抗体在医学中的应用一、检验医学诊断试剂二、 蛋白质的提纯三、肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术U4基因工程抗体1、嵌合抗体：鼠Ig的V区与人Ig的恒定区（C区）基因重组后，在原核细胞或真核细胞中表达，

13、这种嵌合抗体含7580%人抗体，20%鼠抗体,注入人体后可减少人抗鼠抗体的反应。优点：减少了鼠单抗的免疫原性，另外人抗体C区仍可有效地发挥补体激活和与FC受体结合的生物学活性，在构建时可以有目的地选择抗体类型，可有效地发挥抗体的生物效应，已有多种针对不同抗原的嵌合抗体的报道、但多为IgG1亚类。2、人源化抗体：为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，将鼠抗体V区（H、L链）中的3个超变区基因插入人抗体的V区的框架（FR）基因中，这样构建的抗体保留了鼠抗体与抗原结合的特异性。 人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。3、小分子抗体：（1）单链抗体(Single Chain Fv ScFv) （2）重组F

14、ab片断 （3）单域结构VH或VL （4）双特异性抗体 （5）免疫粘连素 （6）催化抗体 4、单链抗体(Single Chain Fv ScFv);它是由抗体重，轻链的可变区基因(VH、VL)之间通过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开展研究和应用。优点：分子量小，易于穿透组织到达靶器官发挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。 5、重组Fab片断：是单价的VH-CH（Fd）和轻链的VL-CL两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相同的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简便。细菌表达的Fab与酶解Ig后所获

15、得的Fab具有相同的功能。 10、基因工程抗体的表达 (一)在哺乳动物细胞（CHO）中的表达 (二)在微生物(原核)细胞中的表达 (三)在植物中表达（四）在酵母中表达 11、导向药物:是由单抗与放射性核素(诊断用)、毒素或化学药物的偶合物，也可用破坏细胞结构的酶、细胞因子等连接，称为生物导弹，可特异地导向靶细胞的特定位点，发挥特意诊断和治疗作用12、噬菌体表面呈现技术（phage display technology）:将Fab或ScFv基因插入噬菌体外壳蛋白基因的g或g区先导序列下游，在噬菌体外壳表面呈现基因表达蛋白13、抗体组合文库技术：将PCR产物VH/VL或L链/Fd链重组到粘粒或杆状

16、噬菌体载体中建立文库14、阳性克隆的筛选:当抗体Fab或ScFv在噬菌体外壳表面呈现后，可采用固相柱层吸附、洗脱、括增的富集性选择法从抗体库中筛选出阳性克隆，从中阳性克隆基因与表达载体重组进行表达。简述抗体检测的几类主要方法。酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫测定（RIA）、免疫荧光测定三种方法。ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于

17、抗原、抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。免疫荧光测定利用某些荧光素，如FITC(异硫氰酸酯)、RB-200(罗丹明)等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测

18、未知抗原或相应配体。放射免疫测定原理： 将放射性核素与抗原-抗体免疫学反应结合，发展出放射免疫测定法U5噬菌体展示技术及其应用1、噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。 2、抗体库技术简单流程：获得抗体基因、插入载体、表达、筛选3、噬菌体cDNA展示技术：1) 以改构的噬菌体为载体，cDNA基因片段定向插入2) 噬菌体外壳蛋白基因区，使外源蛋白表达并展示3) 于噬菌体表面，通过亲和富集法筛选4) 表达有特异蛋白质的噬菌体。4、噬菌体抗体库技术的优势¨ 可实现单抗的小型

19、化¨ 可实现单抗的多功能化¨ 简单易行、生产成本低、筛选容量大、可通过发酵生产、大量制备5、噬菌体抗体库技术的应用¨ 制备人源抗体¨ 制备各级功能抗体片段 ¨ 抗感染 ¨ 抗肿瘤U6转基因小鼠1、制备基因敲除小鼠的主要步骤：1) 获得外源目的基因2) 靶向载体3) 构建同源打靶重组子4) 小鼠ES细胞的准备5) 打靶重组子导入ES细胞及药物选择6) 靶向基因-ES细胞转入胚泡7) ES-胚胎移入假性怀孕的雌性受体鼠及发育8) 嵌合小鼠的近亲交配2、转基因小鼠的应用：基因表达 基因调节 胚胎发育 人类疾病的动物模型 检验基因治疗药物 从

20、转化的特殊细胞类型在体内建立细胞系 组织特异性诱导基因的表达 组织特异性基因删除 研究毒性基因特异性细胞消除的作用 自身免疫耐受机制的研究第七章 抗体的表达1、抗体载体体统的种类:1 哺乳动物表达载体系统 2 大肠杆菌表达系统 3 酵母及昆虫细胞表达系统 4 动植物表达系统 2、哺乳动物表达载体系统优点：1.具有良好生物活性，基本近似于天然抗体。 2.表达产物可分泌至无血清或无蛋白的培养上清中，为抗体的分离纯化提供了最大的便利。 3.能进行规模化培养 4.内质网为抗体分子的正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化-还原环境。缺点：构建周期长、操作烦琐，表达产量相对低，生产成本较高等缺点

21、目前常用的宿主细胞主要有两类，一类是淋巴类细胞，另一类是非淋巴类细胞。抗体表达的策略：抗体基因在宿主细胞染色体上的定位，主要是指抗体基因在染色体上的整合位点以及抗体基因的基因剂量。抗体mRNA的转录，转录效率与mRNA的稳定性是其中最重要的因素。抗体基因的翻译。抗体的翻译后加工、组装。抗体的分泌；针对以上5个环节，设计相应的措施提高各环节的效率，有助于提高基因工程抗体在哺乳动物细胞中的表达水平。此外还有一些实际操作因素的影响，如高表达细胞株的筛选，生产细胞的稳定等等。表达载体含有的基本元件：骨架序列、选择标志基因、表达盒以及一些特殊的调控序列。载体系统分类：A 可扩增表达载体系统。 B 不可扩

22、增表达的载体系统。表达盒：启动子、核糖体进入位点、转录终止信号和polyA加尾信号抗体高效表达的其他因素：1 抗体基因的结构2 抗体表达克隆的筛选3 宿主细胞的选择和筛选3、大肠杆菌表达系统一、大肠杆菌表达系统的特点：是应用最广的源和表达系统，产量高，成本低，周期短等特点。基因表达信号：promoter: 是转录起始信号 Terminator：转录结束的位点 核糖体结合位点（一） 启动子a) 启动子的选择：强启动子可以启动高效率的表达启动子的调控，主要有两种调控方式：诱导：一个诱导的基因是在加入底物后基因的表达才能启动抑制：可抑制的基因是在加入调控物后表达被关闭。b) 表达载体应用的启动子：1

23、) lac启动子 2) trp启动子 3) tac启动子 4) PL启动子（二）启动子下游的SD序列 SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码。酵母表达载体一、外源基因在毕赤酵母中的表达特 点：酵母生长快，易培养，成本低，遗传操作方便，对外源蛋白能进行翻译后修饰和加工。毕赤酵母利用AOX1强启动子或者3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）启动子，可高效表达外源基因。毕赤酵母的细胞密度可达150g/L毕赤酵母可进行糖基化，糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr）毕赤酵母表达

24、外源蛋白通常步骤：1.基因表达载体的构建2.DNA导入酵母细胞3.表达载体染色体整合的菌株4.外源蛋白表达情况5.发酵条件建立高密度发酵方法6.外源蛋白纯化工艺酵母表达系统的特点优点1. 在E coli中以包含体方式表达的蛋白在酵母中大都能可溶表达，大肠杆菌中经常发生的蛋白降解现象，在酵母中也有所改善。2. 酵母表达系统的产量比原核表达系统要高3. 其培养基中的污染物种类很少有助于简化纯化过程。4. 能正确折叠、并且有生物功能的完整抗体分子 。缺点N-糖基化时添加的糖链长度会影响所表达蛋白的性质，即过渡糖基化。在酵母中的糖链(>50个糖基)比哺乳动物的糖链(<20个糖基)长许多，称

25、为过度糖基化。外DNA导入哺乳动物细胞的方法：1. 病毒方式：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、泡疹病毒、腺病毒相关病毒2. 化学法：磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法3. 物理法：显微注射，电转移法、基因枪基因表达产物的检测：1.基因转录水平的检测：Northern Blot，RNA杂交保护，RT-PCR2.蛋白翻译水平的检测：ELISA、Western Blot，高压液相，质谱等3.生物活性的检测：基因打靶的技术流程：1.胚胎干细胞的获得和培养2.打靶载体的构建3.重组ES细胞的筛选4.嵌合体小鼠的制备5.基因敲除小鼠的建立6.Cre-loxP系统、FLP/FR

26、T系统和条件性基因敲除7.基因敲入8.大规模ES细胞突变库的建立干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES)：ESC是从早期胚胎内细胞团（Inner Cell Mass，ICM）或附置后胚胎原始生殖细胞（primordial germ cells ,PGCs)分离克隆出来的一种具无限增殖能力和全向分化能力的干细胞。ES的特点：（1）全能性（2）无限扩增（3）可操作性基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。基因敲除：是使基因组中某个/某几个基因或

27、基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。基因打靶流程：一、胚胎干细胞的获得和培养ES细胞的培养（1）冲洗子宫获得胚泡（2）分离胚泡内细胞团 组织培养法、免疫外科学法、显微外科学法（3）体外培养第八章 抗体的分离纯化及测定第一节 抗体的分离纯化分离：将抗体从其存在的体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。纯化： 提高分离出来的抗体的纯度，并将其中的杂质控制在所需的低水平。对治疗性抗体尤为重要。按分离方法：沉淀、盐析、膜技术、电泳、

28、色谱等。其中只有电泳和色谱法可以将抗体精细分离即纯化。一、盐析法盐析时需注意的问题：1. 盐的饱和度 2. pH 3. 蛋白质浓度 二、膜分离技术(一)超滤膜的基本性能：1透水速率 在一定的驱动压力下，单位面积的膜在单位时间里所能透过的水的量称为该膜的进水率(Jf)。2截留分子量第二节 抗体的测定2 类型（1）间接法测抗体:间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。(2) 双抗体夹心法测抗原：是检测抗原最常用的方法。(3)竞争法测抗原：(4)IgM抗体的检测(5) ABC-ELISA技术（二） 免疫荧光技术荧光抗体制备方法：1.搅拌法：

29、适于体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液优点：标记时间短，荧光素用量少缺点：影响因素多 ；易引起较强的非特异性荧光染色免疫荧光显微技术类型及原理：1间接法2直接法3补体结合法4双标记法5活细胞表面抗原免疫荧光染色法荧光抗体技术的应用：1.细菌学方面：菌种鉴定和Ag结构的研究2.病毒学方面：病毒鉴定和病毒在感染cell内的定位3.免疫学方面：（1）研究（2）用于自身免疫病的诊断（3）T、B细胞亚群的分离及检测4.寄生虫学方面：用于寄生虫的诊断5.其它：激素或酶的组织定位荧光抗体技术的优缺点：优点： 1.Ag和Ab的特异性与形态的检查结合在一起。 2.能做到快速、敏感、定位。 缺点： 1.对组织细胞进

30、行微细结构的观察做不到。 2.标本不能永久保存，荧光有自然消退现象，需及时观察及照相。 3.有非特异性荧光的干扰 （三）放射免疫测定1 原理： 将放射性核素与抗原-抗体免疫学反应结合，发展出放射免疫测定法2 流程： 将可溶性抗原固相化，以无关蛋白封闭，孵育洗涤， 加入核素标记的抗抗体或蛋白A ，再经孵育、洗涤，将固相化板切割，分置小瓶中，以伽玛计数器测定cpm值第八章 ABO血型鉴定及HBSAg测定凝集反应:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。一、直接凝集反应细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝

31、集反应 。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。玻片凝集试验ABO血型鉴定二、间接凝集反应将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。第九章：免疫标记技术免疫标记技术：标记物与免疫活性物质的联接技术标记免疫技术：以标记免疫物质检测相应靶物质的技术第二节 酶标记技术第三节 荧光标记技术常用标记方法：1、荧光素的概念2、生物标记荧光素的要求3、常用荧光素标记原理与方法 生物标记荧光素的要求1、具有与蛋白质共价结合的能力 2、荧光效率高 3、能与背景物质形成鲜明对比 4、不影响蛋白质的生

32、物、免疫活性 5、标记方法安全、简便 6、标记物稳定，易保存 标记免疫物的分离与鉴定1、分离： 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析2、鉴定：抗体活性；标记物结合度；F/P比值的应用意义第四节 放射性核素标记技术标记免疫技术的分类一、按指示标记物质划分的类型：1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、发光免疫技术5、金免疫技术二、按测定方式划分的类型 ：1、均相型（homogenous） 2、非均相型（heterogeneous）三、按测定用途划分的类型：1、免疫测定技术 2、免疫组化技术 第三节 荧光抗体技术荧光抗体技术的原理与方法：1直接法2间接法3补体法4双标记法 第十一章 免疫球

33、蛋白免疫球蛋白：具有抗体活性或化学结构与抗体类似的球蛋白。类型： 分泌型（secreted Ig, sIg） 膜型（membrane Ig, mIg）理化性质：属球蛋白，在电泳图谱上大部分抗体活性在球蛋白，具有异质性。1.可变区（variable region，V区）：位于Ig分子N端，占轻链1/2和重链1/4或1/5；不同抗体其IgV区氨基酸组成和排列有较大差异，并决定抗体与抗原结合的特异性；超变区（hypervariable region, HVR）：在VL和VH中，某些特定位置的氨基酸残基的排列顺序高度可变，此为HVR。轻、重链各有3个HVR。互补决定区（complementarity-

34、determining region, CDR）：超变区乃抗体与抗原（表位）特异性结合的位置，此为CDR。骨架区（framework region, FR）：V区中非HVR部位的氨基酸组成和排列相对保守，此为FR。VH和VL各有4个FR。2.恒定区（constant region,C区)：位于Ig 分子的C端，占轻链1/2和重链3/4（IgA、IgD）或4/5（IgM、IgE）。在同一种属中，同一类重链和同一类轻链C区氨基酸的组成或排列比较恒定。介导Ig多种生物学功能。二、抗体的异质性1.不同抗原表位刺激所产生不同的抗体分子，其识别抗原的特异性不同（V区不同）2.同一抗原表位诱生的不同类型的抗

35、体，其识别抗原的特异性相同（C区不同）3.免疫球蛋白有不同种类4.免疫球蛋白同时可作为抗3、 IgG的基本结构和功能，免疫球蛋白的种类基本结构： 由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成的四肽链分子。功能：（1）是唯一能通过胎盘的Ig，发挥自然被动免疫功能；（2）具有活化补体经典途径的能力（IgG3>IgG1>IgG2）；（3）调理作用、ADCC作用和结合SPA等；（4）参与型、型超敏反应，某些自身免疫病的抗体也属IgG种类：Ig G IgM IgA IgD IgEIg的血清型 1.同种型（isotype）2.同种异型（allotype）3.独特型（idiotype）三、

36、免疫球蛋白的功能V区的功能1.特异性结合抗原；2.抗体结合相应抗原分子，中和作用，发挥免疫效应（生理与病理）；3.BCR特异性识别并结合抗原分子，介导体液免疫应答。C区的功能1.激活补体IgM、IgG13 激活补体经典途径凝聚的IgA或IgG4 激活补体旁路途径2.与细胞表面FcR结合1）调理作用（opsonization)；IgFc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬；2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)3) 介导I型超敏反应3.穿过胎盘和粘膜 IgG通过胎盘；sIgA穿过粘膜C区的功能第十二章 免疫应答免

37、疫应答(immune response)：是机体接受Ag刺激后,免疫细胞对抗原分子的识别、活化、增殖、分化、产生免疫物质发挥特异性免疫效应的过程。二、免疫应答的类型与效果根据机体的反应状态分正应答与负应答（免疫耐受）；正应答据介导这一过程的主要细胞及效应方式不同，分为B细胞介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫。四、免疫应答的过程免疫应答可分为三个阶段，即抗原提呈与识别阶段；活化、增殖与分化阶段；效应阶段。（一）抗原提呈与识别阶段1、对内源性抗原的加工、处理和提呈内源性抗原、胞质溶胶途径（MHC-I类分子途径）2、对外源性抗原的加工、处理和提呈外源性抗原、溶酶体途径（MHC-II类分子途径）（二

38、）活化、增殖与分化阶段（三）效应阶段免疫应答的特征：特异性、记忆性（再次应答）、排异性、放大性、MHC限制性第二节B细胞(抗体)介导的免疫应答：体液免疫：B细胞在抗原刺激下转化为浆细胞,合成和分泌具有特异性免疫功能的球蛋白(抗体),抗体与抗原发生特异性结合,发挥免疫效应。（三）效应阶段三、体液免疫（Ab）产生的一般规律(一)初次应答产生Ab潜伏期长;先产生IgM类,后产生IgG类;总Ab量不高;维持时间短;抗体亲和力随时间增加而增强。(二)再次应答产生Ab潜伏期短;血中Ab 浓度升高快，Ab量高(主要是IgG类);维持时间长；亲和力高。四、体液免疫的生物学效应：1、中和作用2、调理作用3、ADCC作用4、激活补体5、某些情况下参与免疫病理损伤第三节T细胞介导的细胞免疫应答细胞免疫应答是指由T细胞特异性识别Ag开始，并在效应阶段也由T细胞参与的免疫应答过程,简称细胞免疫。三、细胞免疫的生物学效应：抗胞内感染抗肿瘤参与移植排斥反应引起免疫损伤第四节、免疫耐受免