地黄饮片HPCE-DAD指纹图谱的研究(中药材)

1、地黄饮片HPCE-DAD指纹图谱的研究许虎，韩乐，刘训红*，傅兴圣，李俊松，蔡宝昌，沈泽中（南京中医药大学， 江苏 南京 210046）摘要 目的：建立地黄饮片HPCE-DAD指纹图谱分析方法，并对地黄及其炮制品的指纹谱进行比较。方法：采用高效毛细管电泳法进行色谱分离，以60mmol·L 1硼砂 (5%甲醇，Ph 9.5)为运行缓冲液，分离电压为20 kV，波长为210nm，以梓醇为参照物（IS），测定其指纹图谱，并作模糊聚类法分析和相似度评价。结果：初步建立了以7个共有峰为特征指纹信息的地黄饮片HPCE-DAD指纹图谱；发现少数地黄饮片的指纹图谱有一定差异，生品与其炮制品的指纹谱中

2、共有峰相对峰面积差异显著。结论：方法准确可靠，重现性好，可作为地黄饮片内在质量评价的依据。关键词 地黄；高效毛细管电泳二极管阵列检测法；指纹图谱Studies on HPCE-DAD fingerprint of Rehmannia glutinosaXu Hu , HAN Le , LIU Xunhong*, FU Xingsheng, LI Junsong , CAI Baochang，SHEN Zezhong(Nanjing University of Chinese Medicine, Nangjing 210046, China) Abstract Objective: To est

3、ablish the analytical method for the fingerprint of Rehmannia glutinosa by HPCE-DAD and compare the fingerprints of Rehmannia glutinosa and its processed products. Method: Based on the mode of high performance capillary electrophoresis，60mmol·L - 1 sodium borate was used as buffer solution (5%M

4、eOH, pH9.5). The separation voltage was 20 kV and the detection wavelength was set at 210 nm. Catalpol was used as a reference standard，the chromatographic fingerprint were determined. The data were analyzed by fuzzy cluster and fingerprint similarity evaluation software to compare the similarity of

5、 samples. Result: HPCE-DAD fingerprints with 7 common peaks of Rehmannia glutinosa were established preliminarily. It was discovered that a small number of samples differed from others. Regarding to the fingerprints of Rehmannia glutinosa and its processed products，there were obvious differences in

6、the relative areas of common peaks. Conclusion: The method is reliable， accurate and can be used for quality control of Rehmannia glutinosa.Key words Rehmannia glutinosa；HPCE-DAD；fingerprint地黄为地黄科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的块根，具有清热凉血、养阴、生津之功效，始载于神农本草经，列为上品，为我国“四大怀药”之一。中国药典2010版收载有鲜地黄、生地黄、熟地黄，功效

7、各不相同。鲜地黄凉血清火、生津止渴，生地黄清热凉血、滋阴生津，熟地黄补血、滋阴基金项目：江苏省中药炮制重点实验室开放式课题(ZYPZ007) ；南京中医药大学“药用生物资源研究与利用”优秀科技创新团队支持计划作者简介： 许虎(1986-)，男，硕士研究生， 从事中药品质评价研究。*通讯作者：刘训红， Tel：(025)85811511 E-mail：liuxunh1959。临床上也有用生地炭、熟地炭，生地炭长于凉血止血，熟地炭长于补血止血2。现代药理研究表明，地黄对免疫系统、心脑血管系统、中枢神经系统具有显著作用，还具有抗肿瘤、降血糖、抗胃溃疡等作用3。其主要有效成分为环烯醚萜类化合物。目前对

8、地黄的质量控制，多以梓醇等作为考察指标4-5，这种对单一成分的检测不足以全面反映药材的质量，也缺乏专属性。中药色谱指纹图谱用于中药质量控制，比目前沿用的方法提供的信息要丰富，高效液相色谱法已应用于地黄的指纹图谱研究6。本文采用高效毛细管电泳法对地黄饮片指纹图谱的构建进行了探讨，并与其炮制品进行比较分析，以期为规范地黄饮片市场及确保药材内在质量的均一性和稳定性提供较全面的质量控制手段。1 仪器与材料G1600-AX高效毛细管电泳仪（美国Agilent公司），配惠普化学工作站、二极管阵列检测器（DAD）、自动进样器；Rotavapor R-3旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；pHS-3C型pH计（

9、上海康仪仪器有限公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。硼砂（南京化学试剂一厂，分析纯），氢氧化钠（上海化学试剂有限公司，分析纯），乙腈（德国Merck公司，HPLC级），甲醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），无水乙醇（南京化学试剂有限公司，分析纯），盐酸（上海化学试剂有限公司，分析纯），乙酸（南京化学试剂有限公司，分析纯），配制缓冲溶液和供试品溶液所用的水均为重蒸馏水。对照品：梓醇（批号：110808-200508）、桃叶珊瑚苷（批号：111761-200601）、栀子苷（批号：110749-200714）、肉桂酸（cinnamic acid，批号：786-900

10、1）购于中国药品生物制品检定所；毛蕊花糖苷购于上海永叶生物科技有限公司。样品：地黄不同产地（批次）样品编号见表1。S1 S7为商品生地黄，S8 S10为自制生地黄，S11S13为自采鲜地黄，S14为自制熟地黄， S15为自制地黄炭，S16为自制熟黄炭，均经南京中医药大学中药鉴定教研室刘训红教授鉴定为地黄科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根，或生地黄的加工炮制品。其中S11相对应的加工炮制品为S8、S14、S15、S16。留样凭证存放于南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室。表1 地黄饮片样品编号品 名产 地提供厂商批号或采集时间S1生地黄河北南京市

11、中医院080831S2生地黄河北南中医药大百草堂100607S3生地黄河南江苏省中医院20100803S4生地黄河南南京轩德堂中医门诊部100722S5生地黄河南南京市传统中医门诊部100626S6生地黄河南南中医药大国医堂100801S7生地黄河南河南宛西制药股份有限公司1000031S8生地黄河南焦作温县实地采集，品种：温85-520101110S9生地黄河南焦作温县实地采集，品种：沁怀一号20101110S10生地黄河南焦作温县实地采集，品种：红薯王20101110S11鲜地黄河南焦作温县实地采集，品种：温85-520101110S12鲜地黄河南焦作温县实地采集，品种：沁怀一号20101

12、110S13鲜地黄河南焦作温县实地采集，品种：红薯王20101110S14熟地黄河南焦作温县实地采集，品种：温85-520101110S15生地炭河南焦作温县实地采集，品种：温85-520101110S16熟地炭河南焦作温县实地采集，品种：温85-5201011102 方法与结果2.1 电泳条件 未涂渍标准熔融石英毛细管（64.5 cm´ 75 µm，有效长度56 cm，Agilent科技有限公司）；运行缓冲液：60mmol·L 1硼砂 (5%甲醇，Ph 9.5)；检测波长：210 nm；分离电压：20 kV；压力进样：5 kPa×6 s；毛细管温度：2

13、5 。毛细管使用前依次用0.1 mmol·L 1氢氧化钠溶液、重蒸馏水和运行缓冲液压力冲洗5、10、5 min，样品分析间隔用0.1 mmol·L 1氢氧化钠溶液、水、缓冲液平衡3、5、5 min。上述试剂使用前均经0.22m滤膜过滤，并超声脱气。2.2 对照品溶液制备 称取桃叶珊瑚苷20.00 mg、栀子苷5.13mg、毛蕊花糖苷4.02mg、肉桂酸10.32mg，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中；称取梓醇3.92mg，精密称定，置于5mL容量瓶中。上述对照品用50%甲醇溶液溶解并定容至刻度，使上述5种对照品浓度依次为2.000、0.513、0.402、1.032、0

14、.784mg·mL 1，作为对照品储备液。精密量取梓醇2 mL、桃叶珊瑚苷1mL、栀子苷1mL、毛蕊花糖苷1mL、肉桂酸0.4mL，移至10mL容量瓶中，用50%甲醇稀释并定容，即得梓醇0.157mg·mL1、桃叶珊瑚苷为0.200 mg·mL-1，栀子苷0.051mg·mL-1、毛蕊花糖苷为0.040 mg·mL-1，肉桂酸为0.103 mg·mL-1混合对照品储备液。3 2.3 供试品溶液制备 精密称取经50 干燥2 h后的样品粉末（过60目筛）1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50（体积分数）甲醇50 mL，加热回流1.5 h

15、，过滤，滤液用50甲醇定容至50mL量瓶，用0.22 m滤膜过滤，作供试品溶液。2.4 方法学考察2.4.1 精密度试验：取同一批次供试品（S1）溶液，连续进样5次，测定指纹图谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件计算，结果相似度均大于0.98，表明供试品进样精密度良好。2.4.2 稳定性试验：取同一批次供试品（S1）溶液，分别在1、2、4、8、16、24h进样6次，测定指纹图谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件计算，结果相似度均大于0.94，说明供试品溶液在24h内稳定。2.4.3 重复性试验：取同一批次样品（S1）粉末6份，平行操作，制备供试品溶液，测定指

16、纹图谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件计算，结果相似度均大于0.91，表明本法测定的重现性尚好。以上结果表明指纹图谱中各色谱峰的相对迁移时间和峰面积基本一致，相似度较高，符合指纹图谱研究的的技术要求。2.5 指纹图谱的建立 将供试品溶液分别放入自动进样的样品管中，按选定的测试条件进行检测。同一上述实验条件下，测定S1 S10供试品HPCE色谱图。根据不同批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相对迁移时间）等相关参数，进行分析、比较，制定优化的指纹图谱。（图1，图2）图1 地黄的HPCE-DAD指纹图谱1. 梓醇 7.肉桂酸图2 地黄的三维HPCE-DAD指纹

17、图谱2.6 指纹图谱分析2.6.1 共有指纹峰标定： 经对供试品HPCE色谱图的分析、比较，地黄标定7个共有峰作为指纹图谱的特征峰，1、7号峰与对照品对照分别鉴定为梓醇、肉桂酸。以1号峰梓醇为参照峰，分别求出各共有峰与之相比的值（调整迁移时间之比）和各共有峰的相对峰面积（峰面积之比）。（表2）表2 地黄HPCE-DAD指纹图谱中共有峰的相对迁移时间值和相对峰面积峰号1234567相对迁移时间/1.00001.37831.44391.76081.90741.97002.2777相对峰面积S11.00000.18100.41400.90140.72760.56451.4785S21.00000.1

18、4690.38030.86920.78270.59761.4165S31.00000.16600.41900.89130.81620.60081.9308S41.00000.15160.37810.91750.83300.54702.1248S51.00000.18470.36380.78540.78540.50562.3414S61.00000.20100.43851.00170.70760.57481.8787S71.00000.18820.40770.91110.71250.57671.6010S81.00000.19160.36930.94010.78840.53291.6826S91

19、.00000.14980.40570.93270.64650.52021.3596S101.00000.18360.41220.94200.71660.58781.21582.6.2 指纹图谱的聚类分析： 选择地黄HPCE指纹图谱中7个比较明显的共有峰，根据表2中的数据，用SPSS软件中的hierarchical cluster analysis对10个地黄样品进行聚类分析，所用聚类方法为average linkage (between groups)，距离公式为square euclidean distance，得不同样品地黄的聚类分析图。（图3，图4）图3 地黄HPCE-DAD指纹图谱的聚

20、类分析图结果显示，当距离标尺在1时，样品S1、S2、S9，样品S7、S8各归为一类；在2时，样品S3、S6各归为一类；在3时，样品S1、S2、S9与S10归为一类；在4时，样品在S3、S6与S4归为一类；在5时，样品S1、S2、S9、S10与S7、S8归为一类；在10时，样品S3、S6、S4与S5归为一类；当距离标尺在25时，所有样品才归为一类。图4 地黄HPCE-DAD指纹图谱中共有峰组分含量图2.6.3 色谱峰的重叠率： 以地黄对照谱图（R）为基准，按以下公式计算待测样品与对照谱图共有的峰数×2/(待测样品与对照谱图峰数和)×100，110号样品色谱峰的重叠率依次为：8

21、9.45%，89.35%，85.40%，84.10%，82.30%，85.10%，87.65%，87.60%，89.55%，88.90%。2.6.4 相似度评价： 将测试数据导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件，经校正选峰，设定匹配模式，将色谱峰自动匹配，生成对照图谱（图5），进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价。各相似度值如下：S1-0.982，S2-0.987，S3-0.955，S4-0.965，S5-0.930，S6-0.950，S7-0.978，S8-0.977，S9-0.985，S10-0.988。结果表明，地黄样品的指纹谱相似度较好（>0.93）

22、。图5 地黄样品HPCE指纹图谱共有模式2.6.5 鲜地黄、生地黄、熟地黄的指纹谱比较 经对鲜地黄（S11）、生地黄（S8）、熟地黄（S14）、生地炭（S15）、熟地炭（S16）的指纹图谱比较、分析，鲜地黄、生地黄、熟地黄均具有7个共有峰，但色谱峰的重叠率及色谱图相似度具有一定差异；生地炭、熟地炭只具有1个共有峰，色谱峰重叠率及色谱图相似度具有明显差异。以生地黄样品（S8）为基准，计算炮制品色谱峰的重叠率，鲜地黄为94.2%，熟地黄为90.5%，生地炭为7.3%，熟地炭为5.6%；以生地黄（S8）为基准，计算炮制品色谱图的相似度，鲜地黄0.882，熟地黄0.902，生地炭0.161，熟地炭0.

23、144。(图6)图6 地黄的HPCE-DAD色谱图a.鲜地黄 b.生地黄 c.熟地黄 d.生地炭 e.熟地炭1.梓醇 7.肉桂酸3 讨论3.1 电泳条件的优化缓冲液体系、缓冲液浓度及pH值的选择： 实验考察了硼砂-水和硼砂-甲醇体系的缓冲溶液，经反复实验确定以硼砂-5%甲醇溶液缓冲体系，色谱峰峰形、分离度较好。在此基础上，对缓冲液浓度及pH值进行了考察，结果表明，当缓冲液浓度为60 mmol·L-1时各色谱峰的分离度较好；当pH为9.5时各组分可以达到基线分离。分离电压和运行温度的选择： 考察了分离电压在1625 kV范围内对各组分迁移时间的影响，结果表明，当分离电压为20 kV时样品及对照品各待测组分仍然可以达到基线分离且节省时间；考察了运行温度在2025 范围内对各组分迁移时间的影响，结果表明，当运行温度为25 时样品的各组分分离效果好，且分析时间缩短。检测波长的选择： 采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，记录并比较不同波长的色谱图。结果在206 nm检测波长下，色谱图中色谱峰较多，信息丰富。2 指纹谱分析指纹谱分析结果表明，不同批次地黄样品之间既有相关性，又有区别。相应共有指纹峰均已在色谱图上体现，色谱峰重叠率、指纹谱相似度较好，但各峰面积有所不同，说明不同来