关于蔗糖酶活性的研究生物化学实验

1、浙江工业大学海洋学院对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究兰德新 （同组：李建鑫）浙江工业大学海洋学院 食工1201摘要：目的 学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法 蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。结果 通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。为我们将来的实验奠定了技术上的基

2、础。关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE文献综述:蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.361.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质2 ,其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速

3、度反应时间为010min；最适酶量为3.152×1037.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50。而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用 目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在

4、植物体内的时空分布。通过基因工程手段调节植物光合产物和代谢产物的分配是当今研究的热点。植物中蔗糖酶的研究正向分子水平方向发展，无论是其分子结构和作用机理，还是基因表达和调控，都为应用基因工程调节光合产物及代谢组分奠定了基础。对于蔗糖酶的研究，还有很多有待解决的问题：植物蔗糖酶同工酶的种类比较多，其在植物中的特定作用还不甚清楚；蔗糖酶与蔗糖含量有时并不相关，尽管一些转基因植株检测表明其蔗糖酶活性大大降低，但蔗糖水平却与对照差不多；应用基因工程技术抑制蔗糖酶的活力在一些转基因植株的发育过程中也不一致；是否还有其他的代谢产物或物质调控蔗糖酶的表达等。因此关于蔗糖酶的研究还有待进一步深入，需要把生理、

5、生化以及分子生物技术有机结合在一起，对于这些问题的最终解决将有助于更好地理解蔗糖酶在植物中的生理作用。实验1. 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1材料与方法1.1.1试剂 新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来）；醋酸钠（AR）；甲苯（AR）；4mol/L醋酸；95%乙醇（<-20）；0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。0.05 mol/L Tris-HCl pH7

6、.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。1.1.2器材 锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；量筒10ml（×1）25ml（×1）;烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；具塞试管10 ml（×3）；吸球、玻棒、滴管、pH试纸；培养箱；恒温水浴箱；磁力搅拌器，搅拌子；高速冷冻离心机。 1.1.3操作方法 1 酵母的自溶 在250ml锥形瓶中加入冰冻的啤酒酵母20g、醋酸钠1.6g，搅拌1520min，使团块的鲜酵母液化，加1.

7、5ml甲苯用大小合适的软木塞将瓶口塞住，摇动10min使甲苯和酵母液充分混匀，放入37培养箱中保温60h，使酵母自溶。 因本实验采用的是啤酒酵母，故酵母自溶时散发着浓烈的酒香。经自溶后，酵母液得到颜色加深。 2初提取液A 在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，加10ml蒸馏水，摇匀，倒入塑料离心管中，平衡（分给同学酵母液少许少许）后用高速冷冻离心机4、15000r/min离心10min。经离心一次后，离心管中的悬液分两层，上层为黄褐色浆状液体，下层为固体，呈斜面状。取上层液体后再次离心，再取上层液体记体积为VA=19.3ml。取3ml保存，用于后续实验，所提取的液体为初提液A。 3热提取液B将

8、初提液A倒入50ml锥形瓶中，加入3.2ml4mol/L的HAc，变为悬浊液，摇匀后入50水浴中20min。溶液的颜色变浅，呈乳白色。迅速放入冰块中冷却，倒入离心管中，离心，取得上清液，为淡黄色澄清液体，得VB=19.5ml。取3ml保存，用于后续实验。4乙醇沉淀提取液C将热提取液B 倒入100ml小烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加（-20）95%的等体积冰乙醇，30min后继续搅拌5min，烧杯底部产生白色固体，取液体，离心，保留离心管中的固体，用0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得Vc=5.6ml。1.2结果与讨论

9、VA总=VA=19.3ml VB总=VB·VA/(VA-3)=23.1ml VC总=Vc·VA/(VA-3) ·VB/(VB-3)=Vc·VB总/(VB-3)=7.84ml。 酵母菌自溶的时间超过60h不可太多，否则可能使蛋白酶进一步自溶，酶量减少。 也可以用其他酵母品种。如酵母粉（超市有售），可使采购原料、实验操作更为简便。 50下，除了蔗糖酶，可能有其他酶未完全失活，仍留在上清液中。 用乙醇沉淀蔗糖酶时，添加过程中乙醇温度会回升，达不到要求的-20，或者可能有其他与蔗糖酶在乙醇中行为相似的酶，造成误差。1.3结论VA总=19.3mlVB总=23.1m

10、lVC总=7.84ml。2实验2. 蔗糖酶的纯化Q Sepharose-柱层析法2.1材料与方法2.1.1试剂 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；0.5mol/LNaOH；Q Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4保存。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。2.1.2器材 层析柱；梯度混合器;磁力搅拌器，搅拌子；紫外分光光度计；点滴板；尿糖试纸、擦镜纸；止水夹；烧杯、试管。 2.1.3操作方法 1 离子交换柱的填充 将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换

11、剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。 2 缓冲液盐度梯度发生器的安装两个杯子的左边一个杯子内加25ml含NaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液，右边25ml的Tris-HCl pH7.3缓冲液（不得装反），排除气泡（为了保证连通），在低浓度一段装入搅拌子。3柱的平衡将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。4加样将缓冲液放至刚好与交换剂相切，取0.5mlC液，加入交换柱，再放至刚好与交换剂相切，夹紧夹子，上方需加5ml左右的缓冲液。以每管3ml收集加样后液体。共收集9管

12、液体（记为19号）。5洗脱为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液25ml洗穿透峰。连通梯度发生器，进行线性梯度洗脱，直到缓冲液全部用完，再用0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液配置的1mol/lNaCl溶液25ml洗脱。期间总共收集13管液体（记为1022号）。 离子交换柱的再生。6测OD值在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。得到各管的OD值如下：表2-1 加样流出液及洗脱液OD280测定结果表试管号OD值试管号OD值10.371120.10022.673130.11331.6361

13、40.12040.120150.40150.063160.35360.069170.22770.052180.17580.042190.09790.045200.069100.115210.054110.094220.0437.酶活力的测试 用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取15，16两组。酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。得到15管为3+，16管为2+，合并成一管，结果为VD =4.3ml注:用+-表示酶活力+多活力大。2.2结果与讨论VD总=VD·VC

14、总/V样 =4.3×7.84/0.5=67.42ml由数据得表如下：Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表 装柱时不得干柱。此次试验中由于不慎，可能存在干柱的嫌疑。不过及时又添加了 Tris-HCl pH7.3缓冲液，对本次试验的结果影响减到了较小的程度。梯度发生器第一次失误的过程，结果相当于多做了洗穿透峰。在以每管3ml分装液体时，不能很好地控制流量，每管不一定均为标准3ml。2.3结论 VD总=67.42ml3实验3. 蔗糖酶活力的测定3.1材料与方法3.1.1试剂3,5-二硝基水杨酸（1）甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，

15、在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 （2）乙液：称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。 将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置710天后使用。葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml） 准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先在105干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。5%蔗糖、； 0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液 溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml的1 mol/L醋酸调pH到4.6，稀释至2L； 5%蔗糖 用0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液配置； 2mol/L NaO

16、H 溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。3.1.2器材 电炉；恒温水浴;紫外分光光度计；试管、吸管； 3.1.3操作方法 1葡萄糖标准曲线的制作 取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在沸水浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。表3-1 葡萄糖标准曲线的制作试管号012345葡萄糖00.81.01.21.41.6蒸馏水3.02.22.01.81.61.4DNS1.51.51.51.51.51.5总体积4.54.54.54.54.54.5OD0.0000.2170.3850.554

17、0.7360.8892酶活力测定将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：200）；热提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分离液D（1：20）。取8支试管，按表3-2加入各种试剂。表3-2 酶的催化反应项目A（1：200）B(1:200)C（1：200）D（1：20）加样A对A样B对B样C对C样D对D样酶液/ml222222222N NaOH0.50.50.50.535预热10min，同时预热5%蔗糖5%蔗糖22222222立即摇匀，准确计时，反应3min2N NaOH0.50.50.50.5总体积/ml4.54.54.54.54.54.54.54.5取

18、反应液A 0.15ml，B 0.15ml，C 0.25ml，D 0.3ml进行DNS反应，测定540nm处OD值。得到ODA=0.318 ODB=0.170 ODC=0.607 ODD=0.2463.2结果与讨论 绘制葡萄糖标准曲线得：图3-1 葡萄糖标准曲线图总活力单位数=mg/V测·4.5/2·V总·n酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提取液A的总酶活）·100%将数据整理如表所示表3-3 蔗糖酶活力测定结果表 葡萄糖标准曲线的绘制是关键。由图像分析得，绘出的标准曲线上的点总体呈明显的线性关系，且R2=0.9995，较为准确，同时可以看到，第二个数据

19、偏小，第三个数据偏小，第五个数据偏小。 计算所得的酶的回收率数据中，按A,B,C,D逐渐降低，说明每一步的提纯都有损失，且C到D这一步中损失较多。 3.3结论得到葡萄糖标准曲线。通过DNS法，测定了初提液A、热提取液B、乙醇沉淀提取液C、柱分离液D中的总活力单位数，也计算了各个提取液的酶的回收率。4 实验4. 蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算4.1材料与方法4.1.1试剂 试剂A（碱性铜试剂） 取Na2CO3（AR）10g和 NaOH（AR）2g，加蒸馏水30ml，微热溶解：另取酒石酸钠 （Na2C2H3O32H2O，AR）0.1g和CuSO45H2O（AR）0.05g，再加入30ml蒸馏水微

20、热溶解，冷却后将上述两溶液混合，再用水稀释至100ml，即为试剂A。该试剂为含10% Na2CO3，0.1%酒石酸钠和0.05%硫酸铜的0.5mol/L NaOH溶液。保存于塑料试剂瓶中，24至少可使用1个月。溶解于500毫升蒸馏水中。；试剂B（酚试剂） 在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（

21、如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。标准浓度牛血清白蛋白溶液（200g/ml） 精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。；4.1.2器材 分光光度计（使用直径为10nm的比色皿）；刻度吸管0.5ml（×1），2ml（×1），5ml（×1）;试管1.5 cm×15cm（×8）；具塞试管10 m

22、l（×3）； 恒温水浴箱（55）； 4.1.3操作方法 1标准曲线的制作 取6支试管，编号05分别按表4-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在55水浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于660nm波长处测OD值，空白0号位对照。以牛血清白蛋白微克数为横坐标，OD660值为纵坐标，画出标准曲线。表4-1 标准曲线的配置加样表管号012345BSA00.20.40.60.81.0水4.54.34.13.93.73.5试剂A1.01.01.01.01.01.0静置10min（立即充分混匀）试剂B0.30.30.30.30.30.3静置10min（立即充分混匀）试剂B0.20.2

23、0.20.20.20.2混匀55水域5min,测A660OD6000.0000.1850.3340.4540.5750.659 2.未知蛋白浓度的测定按A（1：100）、B（1：100）、C（1：20）、D（不稀释）进行稀释，A稀释液去0.4ml，B、C、D稀释液各取5ml测定OD660(所得数据如上表所示)。 【注意】Folin-酚B试剂在酸性条件下稳定，而Folin-酚A试剂在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚B试剂加入后，应迅速摇匀（加一管，摇一管），使还原反应产生在试剂被破坏之前。4.2结果与讨论表4-2 实验结果数据记录表样品ABCDOD6600.511

24、0.3960.3300.270 图4-1 蛋白质标准曲线图总蛋白=（mg/0.5）·n·V总 单位：mg比活力=总活力单位/总蛋白 单位：mg表4-3 实验数据处理结果汇总表总体积/ml总酶活/u总蛋白/mg比活力/u/mg蛋白回收率/%酶活回收率/%纯化倍数/倍初提取液A19.3031923.91547.2558.341001001.00热提取液B23.1030948.28483.6163.9988.3796.941.097乙醇提取液C7.8422225.3626.15849.914.7869.6214.57柱分离液D67.428483.068.63982.511.582

25、6.5716.84由所得标准曲线可得牛血清蛋白微克数与其对应的OD660呈明显的线关系，其公式为y=0.0031x+0.0715，R2=0.9977，结果较为准确，第一组与第五组数据略偏小。由计算所得数据分析可得，A,B,C,D的比活力依次增加，蛋白回收率及酶的回收率依次减小，纯化倍数依次增加，其中A到B纯化并不明显，B到C有明显的纯化，C到D具有一定的纯化。可见前几个实验的提取有一定效果，所得出的实验结果证明本次实验还是成功的。4.3结论 参见实验数据处理结果汇总表。5 实验5. 微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮5.1材料与方法5.1.1试剂 蛋白样品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶

26、液并稀释至100ml；浓硫酸；硫酸钾3份与硫酸铜1份（质量分数）混合研磨成粉末；30%NaOH溶液:30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml； 2%硼酸溶液：2 g溶于蒸馏水，稀释至100ml； 混合指示剂：01甲基红酒精溶液和 01甲基蓝酒精溶液临时按2:1的比例混合。或01甲基红酒精溶液和 01溴甲酚绿酒精溶液临时按1:5的比例混合 0.01mol/L HCl标准溶液5.1.2器材 改良式凯氏定氮仪；克氏烧瓶50ml（×2）;移液管；锥形瓶50ml（×3）；吸球、玻棒、滴管、量筒； 5.1.3操作方法 1消化凯氏瓶内加入A 0.1ml、B 0.2ml、C 0.25ml

27、和2ml硫酸，半匙催化剂，消化至淡绿色，定容至50ml。2.洗涤定氮仪装配好凯式定氮仪，反应室中加少许水（10ml左右）蒸汽发生室内充入适量额水，加热，冷凝管口用指示剂检测，若指示剂变棕色，须将反应室内的水吸去，重新加入水，至指示剂不变色（颜色保持紫红色不变），则洗涤干净。实际操作时，观察到随着锥形瓶内水量增多，指示剂变棕红色。第三次洗涤后，指示剂不变色。3蒸馏反应室加入5ml消化液，用少许水洗涤小漏斗，冷凝管插入指示剂，用量筒加10ml30%NaOH至反应室，保留少许NaOH在小漏斗中，再加3ml水，缓缓放入反应室，并保留少量水作液封。开始蒸馏至指示剂变绿，再蒸馏3min，使冷凝管离开指示剂

28、。再蒸1min，少量水冲洗管口。重复3次，每次都必须将凯式定氮仪洗涤干净。实际操作时，在加反应液后，反应室内液体变成棕黑色，液体反应剧烈。指示剂有红色变成棕色，最后变成绿色。4滴定用0.01N HCl将锥形瓶中的指示剂滴定至淡紫色，记录消耗HCl的量。5.2结果与讨论 次数12HCl消耗量0.40ml0.45mlHCl浓度：0.01mol/L样品含氮量=(A-B)×N×14.008×V2/（V1×V3）=5.95mg/ml 样品含蛋白质量=5.95×6.25=37.2mg/ml 蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在1

29、4%-18%，平均约含氮16%），所以，可用蛋白氮的量乘以6.25，就是样品的粗蛋白含量。 与分析福林酚法比较，得总蛋白含量大大偏高，原因可能是提取液的纯度有限，细胞中含氮物质的干扰，未做对照组，仪器中有残留。在加入NaOH后，反应室内液体变成棕黑色。是因为CuSO4和过量的NaOH生成铜酸钠，此时会产生氨气。 试样中若含有硝态氮时，首先要使硝态氮还原为铵态氮，可加入水杨酸和硫代硫酸钠，使硝态氮与水杨酸在室温下作用生成硝基水杨酸，再用硫代硫酸钠（Na2S2O3）或Zn粉使硝基水杨酸转化为铵盐。由于水杨酸与硫代硫酸钠会消耗一部分硫酸，所以消化时的硫酸用量要酌情增加。不用C,D提取液是因为其中氮含

30、量较小，难以测出。5.3结论 样品含氮量=5.95mg/ml 样品含蛋白质量=37.2mg/ml6 实验6. SDSPAGE测定蛋白质的相对分子质量6.1材料与方法6.1.1试剂 30%丙烯酰胺贮液: 称丙烯酰胺（AR）29.2g、甲叉双丙烯酰胺0.8g，先用80ml双蒸馏水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸馏水稀释至100ml，过滤。用棕色瓶中，4保存一个月。10%的TEMED；10%过硫酸铵（AP）：现用现配。；分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：取Tris 9.08g溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH8.8，用双蒸水定容至50mL，

31、4保存；浓缩胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：取Tris 6.06g溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH6.8，用双蒸水定容至50mL，4保存；2×SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCl，pH6.8）+4ml10%SDS+1ml巯基乙醇+2mL甘油0.5ml0.1%(质量浓度)溴酚蓝，加双蒸水定容至10mL，4保存。SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）: 取Tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml双蒸水中，加入50ml 10%(质量分数)SDS贮存液，加双蒸水定容至1000mL则成5×SDS-电极缓冲液。 10%SDS：25gSDS用双蒸水定容至250mL，室温保存。 染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入90mL 50%甲醇溶液和10mL冰乙酸，用滤纸过滤。 脱色液：50mL甲醇溶液和75mL冰乙酸，加蒸馏水至1000ml。 蛋白质样品液 标准蛋白质：包括兔磷酸化酶B，相对分子质量97400；牛血清白蛋白，相对分子质量66200；兔肌动蛋白，相对分子质量43000；牛碳酸酐酶，相对分子质量31000；胰蛋白酶拟