产青霉素酶枯草芽孢杆菌的分离、纯化及相关酶活性的检测

1、产青霉素酶杆菌的分离、优化及酶活力的检测一、 实验目的1、了解采集土样的要求和方法。2、掌握由土壤中分离产青霉素酶的基本原理和操作技术。3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。4、学习并掌握细菌培养基的制备。5、学习并掌握细菌发酵液产酶活性的检测方法。二、实验原理青霉素酶(EC3. 5. 2. 6) 是催化水解青霉素-内酰胺环, 使青霉素变成无抗菌活性的青霉素酮酸的一类-内酰胺酶。早在1940 年青霉素还未广泛应用于临床时,Abraham 等就从耐青霉素的E.coliK12 中发现了青霉素酶, 该酶也是关于-内酰胺酶的首次报道。随后在地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌中相继发现了这种特性的青霉素

2、酶。并对地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌产青霉素酶的发酵条件、酶学性质和基因序列进行了研究。虽然细菌产生青霉素酶是导致出现耐药性的原因之一, 但利用青霉素酶具有水解-内酰胺类抗生素的特点, 可将其用于抗生素药品质量检验和新抗菌药物筛选。该酶最具广阔应用前景的用途是用于对牛奶中的青霉素残留量的快速定量测定和对青霉素超标牛乳进行处理。国外在20 世纪80 年代中期就开展了青霉素酶固定化及处理青霉素超标牛乳的研究, 近年对青霉素酶生物传感器的研究非常活跃。另外, 由于青霉素酶具有价格低廉和灵敏度高等优点, 其可在酶联免疫吸附试验(ELISA ) 中替代传统的辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。我国在青霉素酶的研究

3、方面起步较晚。1999 年,中国药品生物制品检定所在我国最先分离出一株能产生青霉素酶的蜡状芽孢杆菌CM CC (B ) 63301, 并对该酶的发酵方法、水解酶谱和保存稳定性等方面进行了研究。该菌株作为青霉素酶产生菌已被收入中国药典。但目前国内在青霉素酶的研究和应用方面的报道较少。枯草芽孢杆菌芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.8×23微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.9×1.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种

4、糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。推荐精选 枯草芽孢杆菌的作用机理：1、枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用； 2、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，

5、间接抑制其它致病菌生长；3、刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；4、枯草芽孢杆菌菌体自身合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用；5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞。三、实验材料1.溶液和试剂牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸铁、1mol/L氢氧化钠、1mol/L盐酸、琼脂、枸橼酸钠、K2HPO42仪器和其他用品试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（pH5.59.0）、棉花、牛皮纸、记号

6、笔、麻绳、纱布、移液枪（20L、200L、1000L）、枪头四、实验步骤及结果注意：所有试验操作均要在无菌条件下进行，防杂菌污染。（1） 操作在无菌室，吴俊祥，超净工作台上进行，双手用70-75%酒精棉球擦拭。（2） 培养容器（试管，培养皿等）要事先灭菌，培养时加盖。（3） 接种用具要灭菌。试验流程：推荐精选 时间安排：5月16日：采集土样（缙云山土，沙土，泥土）。5月19日：土样稀释、倒平板、接种。5月21日：初选菌落，培养24小时。5月22日：配制含有10000单位/mL青霉素的平板5个，将4000单位青霉素的平板上的菌落转接到10000单位/mL青霉素的平板上， 30 培养24小时。5月

7、23日：配制含有20000单位/mL青霉素的平板4个，转接， 30 培养 24小时。5月24日：选出生长较好的12株菌，接种到含有20000单位/mL青霉素的液体培养基试管，摇床培养24小时。5月25日：观察发现只有一支试管（沙3）中液体出现浑浊，保存菌种于一支斜面。5月28日：又发现了3支试管中液体出现浑浊，并将他们保种于斜面。将沙3的菌种取出1mL接到含1万单位青霉素的摇瓶,1mL接到含2万单位青霉素的摇瓶中，摇床培养24小时。同时将3支浑浊试管中的菌液各取出1mL接到含1万单位青霉素的摇瓶中，摇床培养24小时.推荐精选5月29日：正交试验，紫外诱变5月30日：酶活力的测定5月31日：酶活

8、力的测定实验步骤：（一） 菌种的分离与纯化牛肉膏蛋白胨培养基【配方】牛肉膏 3g蛋白胨 10g氯化钠 5g琼脂 15-20g水 1000mlPH 7.0-7.2材料及仪器 土壤样品，无菌水，无菌玻璃棒，接种环，酒精灯，采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔，镊子，圆滤纸片，15×150mm试管，无菌漏斗，牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶(带玻璃珠)，玻璃刮铲，实验具体步骤：称量和溶化 按要求称取药品，并加热搅拌使之溶解。调节pH 先确定溶液此时的PH，再根据情况调节pH至7.0-7.2分装 将配制好的培养基分装入四个200ml的三角瓶，每瓶约150

9、ml，注意不要使培养基粘在瓶口上，以免引起污染。加纱布与包扎 三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用线绳以活结形式扎好，在皮纸上标明名称、组别、日期。灭菌 0.1Mpa 1530min高压蒸汽灭菌。（将培养皿、玻璃棒、分装器一起灭菌。）冷却 待冷却至60，取出两瓶150ml的培养基，向其中一瓶加入18.75mg的青霉素，使其青霉素浓度为200u/ml，倾倒斜面平板，待冷却后，将另外的150ml培养基分装于平板上，是平板成平面，并在平板底部做好标记，浓度的梯度趋势。推荐精选（1）采样：选取离地面510 cm处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。准确取样10克，加入装有90ml无菌水并

10、带有玻璃珠的三角瓶中，震荡约20min，使土样与水充分混匀，静置，取上清液。 （2） 稀释 用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液;以此类推，制成10-1，10-2，10-6等一系列稀释菌液，编号。（3） 将梯度培养基编号。（4） 将无菌平板编上10-3,10-4号码，每浓度涂布两个平板，共有三个土样，每个每个土样接种两个浓度。用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-3 10-4 稀释液各0.1ml放入编号的平板中，再用无菌玻璃棒将菌液在平板上涂抹均匀。（三种土样，每个稀释度各涂布两个培养基，共需要12个培养基）（5） 培养 在

11、30条件下倒置培养24h。菌落的判断菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭,需氧菌. 在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm。 配制青霉素浓度分别为1000u/ml 2000u/ml 4000u/ml浓度的培养基各两个。即共制作6个培养基，待接种使用。（6） 观察不同培养基上菌落的形态，首先根据芽孢杆菌的菌落特诊初步判断菌落种类，然后用结晶紫染色的方法确定是否为所需杆菌，挑选出生长良好的20株杆菌菌落，分别接种于三个不同浓度的培养基中，每个培养基点接10个菌落，30恒温箱中培养24h。 配制青霉素浓度分别为10000u

12、/ml,20000u/ml浓度的培养基各两个，即共配制4个培养基，待接种使用。（7） 观察不同培养基上菌落的生长状况，挑取生长良好的12株菌落，分别接种于培养基上，每个培养基接种6株，在30条件下倒置培养24h。推荐精选 配制青霉素浓度为20000u/ml的LB液体培养基，分装于12支试管中。（8）观察培养基上菌落的生长状况将青霉素浓度为20000u/ml的培养基上的所有菌落都接种于LB液体培养基中，挑取青霉素浓度为10000u/ml培养基上长势良好的菌落也接种于液体培养基中，共挑选了12株，32恒温摇床培养24h。（9）通过培养，有一支试管培养基变浑浊，将试管中的菌种斜面保存。另外，量取试管

13、中菌液各1ml，分别接种在青霉素浓度为10000u/ml,20000u/ml的两个含100ml LB液体培养基中，32恒温摇床培养24h。(10)两个摇瓶培养基中都十分浑浊，分别取菌液保种。【附注】结晶紫染色法结晶紫染色液(Crystal Violet Staining Solution)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成深紫色 染色后的的染色液。用于革兰氏染色.，结晶紫是一种碱性染料，可以和细胞核中的DNA结合，从而产生细胞核染色。简单染色法是一种最基本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，

14、而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色实验步骤： 1、涂片：用消毒棉球擦拭双手，用镊子取干净载玻片一块，在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，涂培养基中生长良好的菌落，做成浓菌悬液。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰23次固定，以不烫手为宜。4、染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加结晶紫染液1-2min。5、水洗：水洗去涂

15、片上的染色液。推荐精选6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉。7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。（二） 菌种的紫外诱变（1）取青霉素浓度为20000u/ml的液体培养基中1ml，按十倍稀释法稀释到10-4 ，然后将稀释1000倍的菌液涂布于5个LB培养基上，分别将5个培养基在紫外线照射45s、75s、105s、135s、165s，同样，将稀释10000倍的菌液涂布5个LB培养基上，紫外线诱变同样时间。（2）30恒温培养24h后，观察菌落生长情况。菌落生长的很小，在培养基靠

16、边缘的地方有很多菌落生长，因为紫外线没有照射到。（3）30恒温继续培养24h后，观察得稀释1000倍诱变135s、稀释10000倍诱变75s的生长情况最好。诱变结果 将生长在稀释1000倍诱变135s、稀释10000倍诱变75s两个培养基上菌落挑取，保存于斜面。（三） 菌种产青霉素酶的条件的选择（1）为了使分离后得到菌种产生更多的青霉素酶，设计正交试验，配制9个100ml的液体培养基，每个培养集成分如下： 蛋白胨 1.5g甘油 5g牛肉膏 0.4-0.5g硫酸镁 0.02g氯化钠K2HPO4枸橼酸钠水定容到 100ml表1.正交表实验设计因素水平氯化钠K2HPO4枸橼酸钠1230.3g0.4g

17、0.5g0.3g0.4g0.5g0.488g0.588g0.688g推荐精选表2.正交表实验方案编号氯化钠K2HPO4枸橼酸钠白色圆直径大小1234567890.3g0.3g0.3g0.4g0.4g0.4g0.5g0.5g0.5g0.3g0.4g0.5g0.3g0.4g0.5g0.3g0.4g0.5g0.488g0.588g0.688g 0.588g0.688g 0.488g0.688g 0.488g0.588gK1K2K3按上述实验方案，将9个培养基32摇瓶培养24h。（2）制备KI淀粉试纸，直径约1cm，配制较大浓度的碘液，将试纸浸润，吹干，滴加10000u/ml的青霉素溶液2微升，分别滴

18、加9瓶中菌液各1微升，观察试纸片白色圈的大小，测量直径，结果如表3所示。表3.正交表实验结果编号氯化钠K2HPO4枸橼酸钠白色圆直径大小（mm）1234567890.3g0.3g0.3g0.4g0.4g0.4g0.5g 0.5g 0.5g0.3g0.4g0.5g 0.3g0.4g0.5g 0.3g0.4g0.5g0.488g0.588g0.688g 0.588g0.688g 0.488g0.688g 0.488g0.588g5.65.86.35.96.25.85.16.15.9K117.716.617.5K217.918.117.6推荐精选K317.118.017.6由结果可知第三组效果最好，

19、将第三组作为测试组。正交试验结果分析： 氯化钠因素第二因素17.9最大，磷酸二氢钾第二因素18.1最大，枸橼酸钠因素第二、三因素17.6最大。因此可知，培养集成分如下： 蛋白胨 1.5g甘油 5g牛肉膏 0.4-0.5g硫酸镁 0.02g氯化钠 0.4gK2HPO4 0.4g枸橼酸钠 0.588g-0.688g水定容到 100ml（四） 酶活力的测定1. 粗酶液的制备（1） 取青霉素浓度为20000u/ml的摇瓶培养基中菌液15ml，4000r/min离心20min，得上清，冷冻结冰，除去杂质，取出结冰后菌液溶化，再次4000r/min离心20min，得上清，即为粗酶液1。（2） 取上述正交试

20、验测试第三组，取15ml，4000r/min离心20min，得上清，冷冻结冰，除去杂质，取出结冰后菌液溶化，再次4000r/min离心20min，得上清，即为粗酶液2。2酶活力的测定（1）青霉素溶液 称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)，溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。 （2）青霉素酶稀释液 取粗酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释1000倍，在37预热。 （3）测定法 精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37后，精密加入已预热的粗酶稀释液25ml，迅速混匀，在37准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01m

21、ol/L)精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。 推荐精选 （4）空白试验 取已预热的青霉素溶液2ml，在37放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加粗酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算： E(BA)×M×F×D×100 式中 E为青霉素酶活力，单位(ml.小时)；

22、B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L； F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的效价（742），单位； D为青霉素酶溶液的稀释倍数。 【附注】 磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水成1000ml。 醋酸钠缓冲液(pH4.5) 取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml；另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml，两液混合均匀。 碘滴定液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100 mL水中，稀释至1 00

23、0mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。3.酶活力测定结果 粗酶液1测定结果，B=10.2ml A=6.0ml 代入公式得 E(BA)×M×F×D×100 =（10.2-6.0）×0.01×742×1000×100 = 3256400（即325.64万） 粗酶液2测定结果，B=11.5ml A=6.6ml 代入公式得 E=（B-A）×M×F×D×100 =(11.5-6.6)×0.01×742×1000×100 =3635800 (即363.58

24、万)五、实验存在的问题、讨论方法及经验总结1碘量法测定酶活力方法重复性很差，在试样测试过程中，我们将粗酶液从10倍稀释到100万倍，分别对照空白试验，测量结果均不是很理想，经过三次试验，取得最优的实验结果。推荐精选2试验过程，空白组消耗的硫代硫酸钠应大于测试组，但实验有时也会出现空白组消耗体积小的情况，而且随着粗酶液稀释倍数的增加，（B-A）的数值也并未见成十倍的减少。理论分析实验过程，青霉素被青霉素酶降解后产生青霉素噻唑酸，青霉素噻唑酸能够与碘产生反应，碘量法测定即加入过量的碘试液，用硫代硫酸钠滴定剩余碘，则酶与青霉素反应的时间越长产生的噻肟酸越多，消耗的硫代硫酸钠越少。实验结果会出现与理论

25、分析相反的结果，可能原因：（1） 提纯酶的过程，酶液含有未知物质，对反映产生干扰大。（2） 粗酶提取后，由于放置时间过长，酶的活力受到影响。3. 酶活力测定的影响因素（1）反应速度大多数酶促反应是可逆反应，其速度既受底物浓度的影响，也受产物生成量的影响。当底物浓度较高时，在反应的初期，其浓度变化甚微，产物生成量也很少，此时反应速度可看作是恒定的。酶反应动力学中所指速度就是反应的初速度。（2）底物浓度 米氏方程=maxS/Km+S是反映酶促反应速度与底物浓度关系的方程式，其中Km称米氏常数。Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。不同的酶，Km值不同。同一个酶有几种底物时，则对每一种底物各有一特定的Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。综上所述，根据酶的特性及定量原理，测定酶活力时，必须注意以下几点：酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐