流式分选原理

1、BD FACSAriaIII流式分选仪的原理及应用BD生物科学 孔祥涛400-819-9900COE_BDB_C 流式分选的原理 流式分选的影响因素 分选流程及注意事项流式分选仪的原理及应用流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术分析型流式细胞仪 VS 分选型流式细胞仪CaliburAriaIIICat

2、ch tuber （捕获管分选）唯一可选配分选装置的小型机。电子偏转的方式 流式分选的原理 流式分选的影响因素 分选流程及注意事项流式分选仪的原理及应用完美的分选纯度纯度得率得率速度速度高速分选的影响因素 鞘液压力（Pressure ) PSI 振荡频率 (Drop Frequency) Hz喷嘴大小 (Nozzle) m上样速度(Sample Flow Rate ) events/sec 分选最重要的问题 Good Purity 分选后所得到的细胞是否是想要的？ Good Recovery 分选后得到的细胞数量是否够用? Good Viability 分选后有多少细胞是活的？Aria III

3、 高纯度 高得率 Sweet spot - 液滴断点自动监控 Accudrop - 液滴延迟自动调节 32等分液滴分辨率，精确分选模式Sweet Spot 液滴断点自动监测液滴断点监测窗口振幅自动调节，维持断点稳定阻塞报警，保护分选样本不受 污染，实现分选时无人看管提高分选纯度和得率高得率分选,来自于液流稳定性Accudrop 液滴延时自动控制专利的BD Accudrop技术能够自动地精确确定液滴延迟时间（细胞颗粒与激光正交的时间和细胞颗粒到达断点处的时间这两个时间的间隔）, 保证最高的分选纯度及得率。全部自动完成精确计算，无需手动调节，并可实时监测。高纯度分选,来自于精确地充电Purity

4、and sort coincidence Purity is also maintained by detecting sort coincidenceAria III 液滴32等分分析高纯度分选,来自于分析的精度Yield MaskTips: 如何提升分选的纯度 设置合适的分选模式 选择合适的喷嘴孔径 确保稳定的液流断点 设置正确的drop delay 进行4路分选时，将纯度要求高的细胞分选设置在最外的2路 减少样本的粘连 正确的设门 确保上样管路清洁后回测Tips: 如何提升回收率 降低分选速度 减少纯度要求 正确的drop delay 正确的加电 合适的收集管 保护细胞活力 正确的设门A

5、ria III 对细胞的保护 高活性 1. 无菌处理 Auto clean 2. 圆滑管路设计 3. NG流动池 低功率激光照射 4. 电子减速 5. 分选样本温控系统 （4、25、37、42）影响细胞活性的因素： 1. 细胞本身状态 2. 细胞受到的撞击 3. 激光照射 4. 细胞所处温度影响 5. 系统洁净程度Tips: 如何提升活力 无菌环境的控制 降低鞘液压力 增大喷嘴孔径，脆弱细胞必须要用大孔径喷嘴 包被样本收集管 温度控制 提升速度 流式分选的原理 流式分选的影响因素 分选流程及注意事项流式分选仪的原理及应用鞘液 必须使用盐离子缓冲溶液作为鞘液，通常是PBS，不建议使用生理盐水 特

6、别需要维持合适的pH值，通常为中性 无菌分选时，需要高压灭菌鞘液（建议一直使用无菌鞘液） 一般不加NaN3 注意更换鞘液过滤器合适样本类型 细胞大小一般不超过喷嘴孔径1/5，绝不能超过1/3 建议无菌样本，容易维持上样针部分的无菌条件 减少有高浓度PI的样本，以免残留在管路内，影响后续样本活性 浓度可在107/ml 一定要使用300-400目孔径过滤网过滤分选前 建议先进行预实验，调整实验设置，并且预估回收率，选择合适的样本量 Ficoll分离过的PBMC使用PBS+ 1% human AB serum 调整浓度到 12 x 107 PBMCs/mL分选中 设门去除粘连体细胞 正确的分析 对于

7、需要后续培养或是对于内毒素特别敏感的细胞，建议完成无菌分选准备流程 选择合适的分选精度 选择合适的喷嘴孔径 选择合适的上样速度以保证纯度和得率分选中 温度的改变对细胞不利，控制上样舱和收集的温度 一些细胞需要特别的培养基或是血清来维持活性，加入不超过2%的血清 pH值的变化同样会对细胞活性有影响，加入不超过25 mM的HEPES到收集管中有助于维持pH 样本的沉降容易导致速度的降低和细胞的聚集，导致堵塞，样本分选前过滤，可使用混匀功能或上样管过滤器，减少此类事件发生收集 收集管预先用human AB serum包被，然后加入0.4 mL X-VIVO 15 培养液 + 10% human AB

8、 serum 及 0.2% acetylcysteine（用于培养），或是PBS + 1% Human AB serum（仅用于回测） 选择合适的收集管，并调节分选液流加电，使得分选液流尽可能打在培养基、PBS、血清的液面上，而不是管壁 收集后的细胞，用250g,10分钟进行离心，小心取上清，用于后续实验提升活性 减少样本收集前后的处理过程，去除不必要的离心和重悬 减少剪切力效应，轻柔使用移液枪 为减少细胞吸附到管壁，收集管使用聚丙烯材质，并用100% human AB serum包被 分选中可暂停，轻柔混匀样本管和收集管，确保细胞悬浮分选后 分选后回测需要确保前后条件一致，确认进样针管路无残留，回测样本无酚红 对于特别少的样本，容易显得杂质比较多 尽量将分选后细胞的洗涤过程减少到1次，并且休整数小时后再进行培养或是后续处理分选后回测1、开液流和高压预热30分2、定期更换鞘液滤器（一年一次）3、分选前检查Nozzle和O-ring 4、及时清洗放置Nozzle的部位和Nozzle Locking Lever 5、检查和更换快速接头o-ring 6、使用PBS（不要使用生理盐水），PBS要过滤（0.2um）仪器的维护保养7、选择合适的喷嘴和压力8、液流启动完，立刻用DI清洗Clos