人肺癌裸小鼠模型活体成像的动态观察

1、人肺癌裸小鼠模型活体成像的动态观察闫明霞1，吴海燕2，朱淼鑫1，刘蕾1，荚德水1，孔韩卫1，姚明1 （1.上海市肿瘤研究所实验病理研究室，上海 200032；2.扬州大学，扬州 225009）摘要 目的：建立稳定表达绿色荧光蛋白的人肺癌细胞系，并探讨小动物活体荧光成像系统在皮下移植瘤模型中的应用。方法：应用慢病毒转染的方法建立表达绿色荧光蛋白的人肺癌细胞系NCI-H460-GFP,并接种至裸小鼠体内建立皮下移植瘤模型，通过小动物活体成像系统连续5周观察肿瘤在动物皮下的动态生长情况。结果：建立了转染率接近100%的NCI-H460-GFP细胞系，在体外及裸小鼠体内均能够长期稳定表达绿色荧光蛋白。

2、活体荧光成像观察发现：1-4周随着肿瘤体积逐渐增大，平均荧光量子数也逐渐增加，5周时随着肿瘤出现明显坏死，平均荧光量子数呈现下降趋势。结论：稳定表达绿色荧光蛋白的NCI-H460-GFP细胞系及其动物模型可以为肺癌研究提供理想的实验材料，应用小动物活体成像系统能够客观定量评价肿瘤在动物体内的生长情况。 关键词 人肺癌；活体成像系统；裸小鼠；绿色荧光蛋白;慢病毒载体Dynamic observation of in vivo biofluorescence imaging of GFP-transfected human lung carcinoma in nude miceYAN Ming-x

3、ia1, Wu Hai-yan2,Zhu Miao-xin1,Liu Lei1, Jia De-shui1,Kong Han-wei1, YAO Ming1 (1. Department of Experimental Pathology，Shanghai Cancer Institute，Shanghai 200032，China；2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)ABSTRACT Objective：To establish a human lung carcinom

4、a cell line, which can stably express green fluorescent protein, and discuss the application of in vivo biofluorescent imaging system in animal model. Methods：Human lung carcinoma NCI-H460 cells were tranfected with gfp gene by lentiviral vector, and they were transplanted into the subcutaneous of t

5、he nude mice for preparing the tumor-bearing mice. The biofluorescent signals were detected in sequential five weeks using in vivo fluorescent imaging system. Results：We had successfully built up a human lung carcinoma NCI-H460-GFP cell line, which can display stable high-level GFP expression in vit

6、ro and in vivo. In vivo fluorescent images showed that the fluorescent intensities gradually increased with the increase of tumor volume in nude mice from one week to four weeks, whereas fluorescent intensities didn't agree with caliper-measured tumor volume in the fifth week. Conclusions：This h

7、igh GFP-expressing cell line and animal model may be useful for the study of lung carcinoma, and in vivo fluorescent imaging system was fitted for evaluation and quantitation of the tumor growth. KEY WORDS： Human lung carcinoma; In vivo imaging system; Nude mice； Green fluorescent protein; lentivira

8、l vector活体成像技术是近几年新兴的一项技术，它是利用活体生物发光或荧光成像技术直接监测活细胞在动物体内的生物学行为及跟踪分子信号，是检测实验动物体内细胞及分子事件的强有力手段，目前已成为医学、生物学及药物开发等1-5研究领域发展最迅速的前沿技术。国内在活体成像技术方面的工作刚刚起步，相关技术尚不成熟。本实验旨在建立稳定表达绿色荧光蛋白的人肺癌NCI-H460-GFP细胞系的基础上，应用活体成像技术动态观察细胞在体内、外的荧光表达情况，为肺癌的深入研究提供理想的实验材料及客观的参考依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1人肺癌细胞株人非小细胞肺癌细胞株NCI-H460来源于国家癌基因及

9、相关基因重点实验室，该细胞在体外用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养。1.1.2实验动物SPF级BALB/cnu/nu裸小鼠7只，68周，体重1822g，雄性，由上海市肿瘤研究所提供实验动物生产许可证号为SCXK(沪)20070001，实验操作及动物饲养严格按照SPF级标准要求进行实验动物使用许可证号为SYXK(沪)20070001。1.1.3仪器和试剂小动物活体荧光成像系统购自德国Berthold Technologies GmbHCo.KG，型号为LB983 NC320，分析软件为WinLight32。荧光显微镜购自OLYMPUS公司。来源于人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的慢病毒

10、载体系统的3种包装质粒PWPXL-GFP、PAX2、PMD2G均来自tronolab公司。胎牛血清购自HyClone公司（Lot No.：NSF0050），培养皿及培养板等购自Greiner Bio-one GmbH。1.2 方法1.2.1 细胞转染病毒包装：将293T细胞铺于10cm培养皿，每10cm培养皿含2-2.5×106个细胞，第二天进行细胞转染。3种质粒PWPXL-GFP 20g，PAX2 15g， PMD2G 6g加水至500ul，加入500ul 2xHBS，混匀。加入50ul 2.5M CaCl2，轻轻混匀，室温放置20-25分钟后滴加入培养基中。6-8小时后，更换培养

11、基。第四天收集培养基，3000rpm室温离心5分钟，0.45 m滤膜抽滤。病毒可直接用于转染或-70度保存。病毒感染：将NCI-H460细胞铺于24孔板，每孔2×104个细胞。将Polybrene 加入24孔板中，终浓度为4g/ml。加入慢病毒，MOI=1000。荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达。1.2.2稳定转染细胞的活体荧光成像检测取生长旺盛的稳定转染细胞，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）常规消化，计数后调整细胞浓度，按50l体积含10，100，1000，1×104，5×104，1×105，5×105，1×106个细

12、胞依次滴加于黑色遮光纸，活体荧光成像系统（发射波长为520nm，激发波长为480nm，曝光时间为1s）检测各细胞浓度的荧光表达情况。1.2.3 肿瘤体内生长的活体荧光成像观察收集生长旺盛的连续传代细胞，调整细胞浓度为1×107个/ml，分别取0.2ml接种于3只裸小鼠右背侧近腋部皮下。当皮下移植瘤长至直径约10左右时剥取出移植瘤，剔除纤维包膜及出血坏死部分，切取生长良好、淡红色、鱼肉状的瘤组织，将其剪切成若干1.5×1.5×1.5的小块，用20号套管针将肿瘤小块逐个移植至其他4只裸小鼠皮下，从而建立皮下移植瘤模型。每周游标卡尺测量皮下移植瘤直径，计算移植瘤体积并绘

13、制肿瘤生长曲线。使用小动物活体成像系统检测GFP表达的发射波长为520nm，激发波长为480nm，曝光时间为1s。每周观察皮下移植瘤生长情况，并定量分析各时间点的荧光值，连续观察5周。以肿瘤接种天数为横坐标，肿瘤接种部位单位面积荧光值为纵坐标，绘制皮下肿瘤生长曲线。1.2.4统计学处理将所有数据用SAS8.2软件进行处理，相关性采用SPEARMAN等级相关进行分析，双侧检验水准为0.05。计量资料以均值±标准差（±s）表示。荧光值按公式：平均荧光量子数=总量子数/荧光面积进行计算。移植瘤体积按公式：V=a×b2 /2(V为瘤体积，a为长径，b为短径) 进行计算。2

14、 结果2.1 GFP标记的肿瘤细胞GFP标记的NCI-H460细胞为多边形上皮样细胞，贴壁生长，荧光显微镜观察可见细胞表达的荧光信号较强，荧光较为均匀地分布于整个细胞内，转染率接近100%，细胞在体外能够稳定表达绿色荧光蛋白，并且随体外长期传代培养无明显消退（图1）。 图1 稳定高表达GFP的NCI-H460-GFP细胞(A) NCI-H460-GFP细胞荧光图（×200） (B) NCI-H460-GFP细胞明场图（×200）Fig1 Stable and highlevel GFP expression NCI-H460-GFP ceils in vitro(A)Ima

15、ge of NCI-H460-GFP cells visualized with an inverted fluorescence microscopy(200×magnification). (B)Image of (A) visualized with an inverted microscopy(200×magnification).2.2活体荧光成像检测NCI-H460-GFP的体外表达通过活体荧光成像系统观察NCI-H460细胞不同浓度的荧光表达，结果可见：该成像系统能够检测的最小细胞数为100个肿瘤细胞，仪器灵敏度较高，随着细胞浓度的递增，荧光表达的强度也逐渐增

16、加，即平均荧光量子数与细胞浓度成正比(图2)。A B C图2 活体荧光成像系统观察不同浓度细胞的绿色荧光蛋白表达(A)不同浓度NCI-H460-GFP细胞活体成像伪彩图 (B) 不同浓度NCI-H460-GFP细胞活体成像软件分析参考图 (C) 不同浓度NCI-H460-GFP细胞荧光定量Fig.2 GFP expression of NCI-H460 with different cells concentrations in vitro observed by in vivo biofluoresent imaging system(A)Pseudo-color image of NCI-

17、H460-GFP cells with different cells concentration .(B)Reference image of dimensional distribution and relative amplitude of fluorescence drown by Winlight 32 software. (C) Quantification of fluorescence of NCI-H460-GFP cells. 2.3活体荧光成像动态观察NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生长NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生长潜伏期约5天，1周时肿瘤大小不能用游标卡尺

18、测量，2周时肿瘤进入对数生长期，至5周时移植瘤体积可达（3782.00±852.89）3，4只动物皮肤表面都出现了不同程度的坏死。应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第4周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光的面积逐渐增大，荧光量子数也逐渐增加，移植瘤体积与荧光量子数成正相关（R=0.86713,P<0.001）。5周时，由于部分动物的皮下肿瘤出现了坏死，因此，尽管肿瘤体积仍在增加但平均荧光量子数反而呈现了下降趋势,移植瘤体积与荧光量子数无相关性（R= R=-0.2000,P>0.05）（图3，4，5）。 1w 2w 3w 4w

19、5w图3 活体荧光成像动态检测NCI-H460-GFP细胞在裸小鼠体内的表达Fig.3 Dynamic observation of in vivo biofluorescent imaging of the NCI-H460-GFP tumor in four nude mice from 1 week to five weeks图4 NCI-H460-GFP的肿瘤生长曲线与与荧光值的动态变化Fig. 4 The tumor growth curve of NCI-H460-GFP and dynamic change of biofluorescence图5肿瘤体积与荧光值的相关性分析Fi

20、g. 5 The correlation analysis between tumor volume and biofluorescence during tumor proliferation讨论活体荧光成像技术自从出现以来已经成为了生命科学和医学研究的强有力的手段。与之密切相关的活细胞标记技术也得到了越来越快速的发展。1994年Chalfie6等首次在大肠杆菌和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河，近年来，绿色荧光蛋白已成为应用最为广泛的标记性蛋白质之一。与-半乳糖苷酶（LacZ）、萤火虫荧光素酶（Luc）等报告基因相比，gfp基因表达的绿色荧光蛋白受到蓝光或紫光照射时可自发地发

21、出绿色荧光，荧光信号强度高，易于被捕获，无需其他底物或辅助因子的协助便可直接通过活体成像系统、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等进行检测，观察极其直观方便7。此外，它还具有稳定性好、耐受性强、对组织或细胞无毒性、易于构建载体等优点。因此，GFP在肿瘤的生长、药效评价和基因治疗等方面都得到了广泛的应用。但是，由于GFP的发射波长较短因而穿透力稍差，在肿瘤应用研究的某些方面仍然存在一定局限性。如YANG等8认为荧光的强弱与肿瘤大小、深度有关，浅表部位可以检测到的最小病灶为59m；而深部肿瘤由于受到周围组织的干扰，小的病灶常难以显示。Caceres等9也证实GFP标记的肿瘤细胞适合于对浅表部位的肿瘤进行

22、成像研究，而荧光素酶标记的细胞适合于对深部组织的原发与远处转移灶进行研究。基因转染技术是分子生物学的常用技术之一，转染所用载体主要包括病毒载体（逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等）和非病毒载体（脂质体、DEAE-葡聚糖、磷酸钙共沉淀、电穿孔等）。慢病毒( lentivirus)属逆转录病毒亚属,具有能够转染分裂和非分裂的细胞、目的基因整合入靶细胞稳定表达治疗基因,无明显免疫反应等特性,同时能够转染广泛的组织、能够被浓缩成高滴度等优点10。脂质体载体最主要的优点是介导的目的基因大小不受限制、无生物源性和毒性，更安全可靠。但是它的转染效率较低，转染效果不稳定，在动物体内缺少G418的选择压力作用下只能短

23、暂表达，随着新的肿瘤细胞的不断复制分离，表达的荧光强度会逐渐衰退。本实验以来源于人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的慢病毒为载体，成功建立了能够在体外和体内都能稳定、长期、高效表达绿色荧光蛋白的NCI-H460-GFP细胞，为活体荧光成像系统的进一步应用打下了坚实的基础。 活体动物体内光学成像技术具有极高的灵敏度，对疾病动物模型微小病灶的检测灵敏度极高；该技术能够进行无创、实时、动态的动物活体观察，从而对同一实验对象进行不同时间点的观察，减少实验动物个体间差异，与传统的实验方法相比，可以大大减少动物的用量，符合替代、减少、优化的“3R”原则。本实验在成功建立表达绿色荧光蛋白的人肺癌细胞系NCI

24、-H460-GFP的基础上，使用活体成像系统对不同浓度的细胞进行了体外荧光表达检测，结果发现100个细胞就可以检测到，说明成像系统具有较高的检测灵敏度。通过连续动态观察NCI-H460-GFP在裸小鼠体内的生长情况，发现成像系统在肿瘤皮下移植7天时就可以检测到荧光的表达，此时按传统方法尚无法测量移植瘤体积。随着移植瘤体积的不断增加，成像系统可以通过平均量子数客观地描述肿瘤的生长，所得数据与游标卡尺测量的肿瘤体积相对应。至5周时瘤体表面出现坏死以后，尽管游标卡尺测量的肿瘤体积仍在增加，但成像系统所测的荧光量子数反而呈现下降趋势，原因可能是GFP属于报告基因只能在活细胞中才能表达。活体成像系统能够

25、更加准确地反应肿瘤生长的实际情况，有利于减小人为实验误差，所获得的实验结果更加直观可靠。同时，应用该系统也可以使实验动物的用量大为减少，节约了实验成本，而且是以自身为对照动态追踪肿瘤的生长变化，有效的排除了动物个体间差异的影响。 本实验应用慢病毒转染的方法成功建立了人肺癌NCI-H460-GFP细胞系，通过小动物活体成像系统检测证实该细胞具有在体外和动物体内均能稳定、持续、高效的表达绿色荧光蛋白的特点。另外，活体成像系统具有较高的灵敏性，能够客观评价NCI-H460-GFP细胞在裸小鼠体内的生长情况，为成像系统的在肺癌的发展机理、药物治疗、基因治疗等方面研究提供重要的参考依据。 致谢：真诚感谢

26、“国家癌基因及相关基因重点实验室”李宗海副研究员对本实验的指导和帮助。参考文献：1 ANDY J. MINN,GAORAV P. GUPTA,PETER M.SIEGEL, et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lungJ.Nature,2005,436:518-524.2EBEN L.ROSENTHAL,BRIAN D.KULLBERSH,TERESA KING, et al. Use of fluorescent labeled antiepidermal growth factor receptor antibody

27、to image head and neck squamous cell carcinoma xenograftsJ. Molecular Cancer Therapeutics，2007,6（4）：12301238.3KENSUKE YAMAUCHI,MENG YANG,PING JING, et al. Development of real-time subcellular dynamic multicolor imaging of cancer-cell trafficking in live mice with a variable-magnification whole-mouse

28、 imaging systemJ.Cancer Res,2006,66(8): 4208-6214.4 TERESA GARCIA, AMANDA JACKSON,RICHARD BACHELIER, et al. A convenient clinically relevant model of human breast cancer bone metastasis J. Clinical & Experimental metastasis, 2008, 25(1):33-42.5 SOHAIL F. TAVAZOIE,CLAUDIO ALARCON,THORDUR OSK

29、ARSSON, et al. Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis J.Nature,2008,451:147-152.6CHALFIE M, TU Y, EUSKIRCHEN G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression J.Science, 1994,263: 802-805. 7PAUL T. WINNARD JR, JESSICA B. KLUTH, VENU RAMAN. Noninvasive optical tracking of red