实验二+分子荧光光谱法2014.10.20

1、实验二实验二 荧光光谱法荧光光谱法一、概述1.1. 1.1. 分子发光分析法及其分类分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光。这种现象称为分子发光。 在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量受激量受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理

2、不同分根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：为以下几类： 光致发光：以光致发光：以来激发而发光来激发而发光 电致发光：以电致发光：以来激发而发光来激发而发光原子发射光谱法原子发射光谱法 生物发光：以生物发光：以激发而发光激发而发光 化学发光：以化学发光：以激发而发光激发而发光化学发光分析法化学发光分析法荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法1.2. 1.2. 分子荧光分析法的特点分子荧光分析法的特点 灵敏度高灵敏度高 检测限荧光分析法比分光光度法低检测限荧光分析法比分光光度法低24个数量级，个数量级， 检测范围检测范围10-810-10 g/mL 选择性好选

3、择性好 荧光波长较长，比较容易排除其它物质的干扰荧光波长较长，比较容易排除其它物质的干扰 实验方法简单实验方法简单 待测样品用量少待测样品用量少二、荧光光谱法的基本原理2.1 2.1 分子荧光的产生分子荧光的产生基态单基态单重重态态第一激发单第一激发单重态重态 第一激发第一激发三重态三重态 禁阻跃迁禁阻跃迁允许跃迁允许跃迁 PauliPauli不相容原理：分子中同一不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。相反的自旋方向，即自旋配对。 电子激发的多重态：电子激发的多重态：M=2s+1 M=2s+1 单重态单重态: : 分子中全部轨

4、道里的电分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的子都是自旋配对的, s=0,M=1, s=0,M=1 三重态三重态：电子在跃迁过程中还伴：电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，随着自旋方向的改变，s=1,M=3s=1,M=32.1.1 分子分子能级与电子能能级与电子能级的多重性级的多重性2.1.2 分子分子荧光的产生荧光的产生 分子室温时处于电子能级的基态，当吸收光辐射后基态分子中电分子室温时处于电子能级的基态，当吸收光辐射后基态分子中电子只能跃迁激发单重态的各个不同的振动子只能跃迁激发单重态的各个不同的振动-转动能级，根据自旋禁转动能级，根据自旋禁阻选律，不能直接跃迁到激发三重态阻选律，不能直

5、接跃迁到激发三重态 各能级。各能级。处于激发态处于激发态的分子是不稳定的，通常以辐射跃迁和无辐射跃迁释的分子是不稳定的，通常以辐射跃迁和无辐射跃迁释放多余的能量而返回到基态，发射荧光是其中一条途径。放多余的能量而返回到基态，发射荧光是其中一条途径。 第一第一电子电子激发三重态激发三重态T T1 1* *能量基态基态S S0 0第一电子第一电子激发单重态激发单重态 S S1 1* *第二电子第二电子激发单重态激发单重态S S2 2* * 荧光荧光系间跨越系间跨越内转换内转换磷光磷光吸收吸收吸收吸收外转换外转换 振动弛豫振动弛豫122.2.1 振动弛豫（振动弛豫（vibrational relex

6、ation)：从电子激发态的从电子激发态的某一振动能级到达同一电子激发态的最低振动能级的过程。某一振动能级到达同一电子激发态的最低振动能级的过程。特点特点：发生发生在同一个激发态的电子能级在同一个激发态的电子能级上；时间上；时间约约10-12秒。秒。2.2 2.2 分子发光的产生分子发光的产生第一第一电子电子激发三重态激发三重态T T1 1* *能量基态基态S S0 0第一电子第一电子激发单重态激发单重态 S S1 1* *第二电子第二电子激发单重态激发单重态S S2 2* * 荧光荧光系间跨越系间跨越内转换内转换磷光磷光吸收吸收吸收吸收外转换外转换 振动弛豫振动弛豫12第一第一电子电子激发三

7、重态激发三重态T T1 1* *能量基态基态S S0 0第一电子第一电子激发单重态激发单重态 S S1 1* *第二电子第二电子激发单重态激发单重态S S2 2* * 荧光荧光系间跨越系间跨越内转换内转换磷光磷光吸收吸收吸收吸收外转换外转换 振动弛豫振动弛豫122.2.2 内转换内转换（internal conversion)：当两个电子的能级当两个电子的能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，电子常常由高能级以非非常靠近以致其振动能级有重叠时，电子常常由高能级以非辐射跃迁方式转移至低能级，这种辐射跃迁方式转移至低能级，这种过程也称为过程也称为内部能量内部能量转换。转换。特点：两个电子的能级非常靠

8、近以致其振动能级有重叠时内特点：两个电子的能级非常靠近以致其振动能级有重叠时内部转换易部转换易发生；发生；10-1310-1 秒秒可完成。可完成。第一第一电子电子激发三重态激发三重态T T1 1* *能量基态基态S S0 0第一电子第一电子激发单重态激发单重态 S S1 1* *第二电子第二电子激发单重态激发单重态S S2 2* * 荧光荧光系间跨越系间跨越内转换内转换磷光磷光吸收吸收吸收吸收外转换外转换 振动弛豫振动弛豫122.2.3 外部外部能量转换（能量转换（external conversion)：在在溶液中溶液中激发态分子激发态分子与溶剂分子之与溶剂分子之间或其他间或其他分子的碰撞而

9、失去能量，分子的碰撞而失去能量，常以热能的方式放出，这个常以热能的方式放出，这个过程也称为外转换。过程也称为外转换。特点：特点：发生在分子发生在分子与分子的碰撞与分子的碰撞时；时间时；时间约约10-910-7秒。秒。第一第一电子电子激发三重态激发三重态T T1 1* *能量基态基态S S0 0第一电子第一电子激发单重态激发单重态 S S1 1* *第二电子第二电子激发单重态激发单重态S S2 2* * 荧光荧光系间跨越系间跨越内转换内转换磷光磷光吸收吸收吸收吸收外转换外转换 振动弛豫振动弛豫122.2.4 系间跨越系间跨越（intersystem crossing)：处于受处于受激分子的激分子

10、的电子在激发态电子在激发态发生自旋反转而改变分子多重发生自旋反转而改变分子多重性的性的过程，例如过程，例如：S1* T1。特点：振动能级重迭时，产生体系间跨越的可能特点：振动能级重迭时，产生体系间跨越的可能大；跨越大；跨越后，后，荧光量子荧光量子减弱，甚至减弱，甚至会荧光会荧光熄灭。熄灭。影响系间跨越的影响系间跨越的因素：因素：含重原子如碘、溴等的分子，体系间跨越最为常见。在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也能增加体系间跨越的发生几率。2.2.5 荧光荧光（Fluorescence)：电子由第一激发态单线态电子由第一激发态单线态的最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而发射的光量的最低振动能级跃迁到

11、基态的任一振动能级而发射的光量子为子为荧光。荧光。特点特点：荧光的能量小于所吸收的紫外光的能量，故发射荧：荧光的能量小于所吸收的紫外光的能量，故发射荧光的波长比吸收的紫外光波长更长；时间约为光的波长比吸收的紫外光波长更长；时间约为10-910-7秒。秒。第一第一电子电子激发三重态激发三重态T T1 1* *能量基态基态S S0 0第一电子第一电子激发单重态激发单重态 S S1 1* *第二电子第二电子激发单重态激发单重态S S2 2* * 荧光荧光系间跨越系间跨越内转换内转换磷光磷光吸收吸收吸收吸收外转换外转换 振动弛豫振动弛豫12第一第一电子电子激发三重态激发三重态T T1 1* *能量基态

12、基态S S0 0第一电子第一电子激发单重态激发单重态 S S1 1* *第二电子第二电子激发单重态激发单重态S S2 2* * 荧光荧光系间跨越系间跨越内转换内转换磷光磷光吸收吸收吸收吸收外转换外转换 振动弛豫振动弛豫122.2.6 磷光磷光（Phosphorescence)：由第一电子激发态：由第一电子激发态三重三重态态的最低振动能级跃迁到的最低振动能级跃迁到基态任一基态任一振动能级发射的光量子为振动能级发射的光量子为磷光。磷光。特点特点：磷光能量比荧光小，波长比荧光：磷光能量比荧光小，波长比荧光长；发射长；发射时间时间长，约长，约为为10-410秒（原因是分子激发三重态的寿命较长）。秒（原

13、因是分子激发三重态的寿命较长）。去去活活化化辐辐射射跃跃迁迁非非辐辐射射跃跃迁迁荧光荧光磷光磷光振动驰豫振动驰豫系间跨越系间跨越内转换内转换外转换外转换 处于处于激发态的分子或激发态的分子或原子通过碰撞，以热原子通过碰撞，以热能或动能的形式消耗能或动能的形式消耗其能量，降低到较低其能量，降低到较低能级，这种能级的变能级，这种能级的变化叫无辐射跃迁化叫无辐射跃迁。 处于激发态的分子或处于激发态的分子或原子通过发射出一定原子通过发射出一定波长的光，以辐射的波长的光，以辐射的形式回到基态，这种形式回到基态，这种能级的变化叫能级的变化叫辐射跃辐射跃迁迁 ( (光致发光光致发光) )2.3 2.3 无辐

14、射跃迁与无辐射跃迁与辐射跃迁辐射跃迁熄灭或猝灭熄灭或猝灭激发光去除后，激发光去除后，荧光立即消失荧光立即消失激发光去除激发光去除后，磷光不后，磷光不会立即消失会立即消失三、激发光谱和发射光谱3.1 激发光谱激发光谱（excitation spectrum) ：不同不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长的荧光所得的光谱。激发波长的辐射引起物质发射某一波长的荧光所得的光谱。即固定发射光波长即固定发射光波长em，依次改变激发波长，依次改变激发波长ex测荧光强度测荧光强度F，以以F-ex作作得荧光物质的得荧光物质的激发光谱。激发光谱。200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧

15、光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱3.2 发射光谱发射光谱（emission spectrum)又又称为荧光光谱称为荧光光谱（fluorescence spectrum)：即即固定激发光波长固定激发光波长ex，依次，依次改变发射波长改变发射波长em 测荧光强度测荧光强度F、以、以F- em 作图作图得得荧光光谱。荧光光谱。200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱3.3 荧光光谱荧光光谱的的特点特点3.3.1. 斯托克斯斯托克斯位移（位移（Stocks shift

16、)：荧光发射波长总是大于：荧光发射波长总是大于激发光波长激发光波长。原因原因：激发态分子由于内部能量转换和振动驰豫过程而迅速：激发态分子由于内部能量转换和振动驰豫过程而迅速到达到达S1*电子态的最低振动能级，从而存在着无辐射能量损失。电子态的最低振动能级，从而存在着无辐射能量损失。200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱3.3 荧光光谱荧光光谱的的特点特点3.3.2. 荧光荧光发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关。原因原因：荧光发射发生于第一电子激发态的最低能级，与分子激：荧光

17、发射发生于第一电子激发态的最低能级，与分子激发至那一个电子能级无关（即使分子激发到高于发至那一个电子能级无关（即使分子激发到高于S1S1* *的电子态的的电子态的更高振动能级，可通过内转换和振动驰豫等无辐射跃迁的形式更高振动能级，可通过内转换和振动驰豫等无辐射跃迁的形式释放能量回到第一电子激发态的最低能级）释放能量回到第一电子激发态的最低能级）。*3.3 荧光光谱荧光光谱的特点的特点3.3.3.荧光光谱与激发光谱呈对称镜像关系荧光光谱与激发光谱呈对称镜像关系。蒽的激发光谱和荧光光谱（溶剂：环己烷）蒽的能级跃迁图四、影响荧光强度的因素4.1 4.1 荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系4.1

18、.1 跃迁类型跃迁类型结构结构中有中有*，n*；而；而n*引起是弱吸收，有时不足以引起是弱吸收，有时不足以发射荧光，只有分子只能够存在共轭的发射荧光，只有分子只能够存在共轭的*跃迁，也就是跃迁，也就是K带带强吸收时，才可能有发生荧光强吸收时，才可能有发生荧光。4.1.2 共轭效应：共轭效应：当当电子共轭越长，电子共轭越长，ex和和em都将长移，荧光强度（荧光效率）都将长移，荧光强度（荧光效率）也会增大。也会增大。4.1.3 刚性平面刚性平面在在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光强同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光强度（荧光效率）也会增大，并且荧光波长产生长移度（

19、荧光效率）也会增大，并且荧光波长产生长移。4.1 荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系4.1.4 取代基效应取代基效应. 给电子基团给电子基团能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。荧光波长长移。例如：例如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等等. 吸电子基团吸电子基团会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。灭。例如：例如：-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等等卤素取代基会随着原子序数的增加而减少荧光效率，这可

20、能卤素取代基会随着原子序数的增加而减少荧光效率，这可能是由于重原子效应。是由于重原子效应。例如：例如：-R、-SO3H、-NH3+等等. 对对电子共轭体系作用较小的取代基对荧光的影响不明显。电子共轭体系作用较小的取代基对荧光的影响不明显。4.2 荧光与环境因素的关系荧光与环境因素的关系4.2.1 温度温度 温度温度越高，荧光效率越小；反之，温度越低，荧光效率越越高，荧光效率越小；反之，温度越低，荧光效率越大大4.2.2 溶剂溶剂溶剂溶剂介电常数增大，极性介电常数增大，极性增大增大，增大；溶剂粘度增大，增大；溶剂粘度增大，f增大，增大，F增大。增大。溶剂溶剂含重原子或溶液、溶解氧（含重原子或溶液

21、、溶解氧（CBr4,C2H5I等），体系间跨越几率增大。等），体系间跨越几率增大。使使f减小，甚至熄灭。减小，甚至熄灭。4.2.3 pH4.2.4 荧光荧光熄灭（熄灭（fluorescence quenching) 定义：荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄定义：荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象灭的现象。常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。 4.2.5 散射光、拉曼光散射光、拉曼光、瑞利光瑞利光五、荧光分析与应用当当EcL0.05时，经泰勒级数展开得：时，经泰勒级数展开得：根据根据Bee

22、r定律：定律：溶液产生荧光的光路示意图溶液产生荧光的光路示意图5.1 荧光强度荧光强度与荧光物质浓度的关系与荧光物质浓度的关系5.2 荧光分析荧光分析技术及技术及应用应用近红外近红外荧光光谱荧光光谱仪仪汞离子汞离子荧光探针荧光探针在活在活细胞的汞信号细胞的汞信号识别识别Nikon单分子荧光系统单分子荧光系统2014年诺贝尔化学年诺贝尔化学奖授予美国奖授予美国科学家科学家埃里克埃里克白兹格白兹格(Eric Betzig)，德国科学家，德国科学家斯特凡斯特凡W赫尔赫尔(Stefan W. Hell)，美国科，美国科学家学家威廉姆威廉姆艾斯科艾斯科莫尔纳尔莫尔纳尔(William E. Moerner)，以表彰他，以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成绩。们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成绩。六、荧光光谱仪吸收池吸收池光源光源检测器检测器单色器单色器信号显信号显