彩图骨髓干细胞体外组织工程软骨形成实验探究

1、彩图骨髓干细胞体外组织工程软骨形成实验探究作者：宋世锋，肖海涛，武伟，袁素，谢瑶云，吴多 能，白殿卿【摘要】目的探讨骨髓干细胞(bmscs)在体外不同载体 中软骨形成的能力和可行性。方法分离培养猪bmscs,将 第3代bmscs以载体内多点注射和表面点滴法植于a组：ii 型纤维胶原蛋白海绵(fibrin collagen sponge), b组：生 物蛋白海绵(fibrin collagen sponge and bfgf) ；c 组：明 胶海绵(gelatin sponge) 3种载体上，于4周取材进行组织 学分析。结果纤维胶原蛋白海绵和生物蛋白海绵组均有软 骨细胞形成，明胶海绵无细胞生长。

2、利用spss 10.0软件统 计学处理，显示b组软骨细胞阳性数量(92. 75±10. 57)多于 a组(36. 45±&34),有统计学差异(p&lt；0. 01),两组都明 显多于c组(0),有统计学差异(p&lt；0. 01)o 结论mscs经 分离扩增后种植于三维立体结构的纤维蛋白海绵载体上，在 含有tgf b 1培养液中形成软骨；在tgf b 1和fgf的双 重因子培养中，其软骨的形成能力明显增加。【关键词】骨髓基质细胞；载体；软骨形成；组织工程abstract : objectiveto investigate the chondroge

3、nic ability and feasibility of bone mesenchymal stem cells (bmscs) in three kinds of cellular carriermethodbmscs were separated and cultured into the third generation,which were cultivated in three knids of carriers by multi point injection into and dropping on the surface of carriers(fibrin collage

4、n sponge, group a； fibrin collagen sponge and fgf,group b and gelatin sponge, group c )all samples were analyzed after four weeksresuitthere were a few chondrogenic cells in group a,much more chondrogenic cells in group b,and no cells in group c according to analysis with spss 10. 0 software,there w

5、ere more cartilage cells (92. 75+ 10. 57) in group b than in group a(36.45±8.34). it was statistical different (p&lt；0.01). conclusionbmsc can be formed to chondrogenesis after augmented and cultivated in the three dimensional fibrin collagen sponge with the medium of contained transforming

6、 grow th factor b 1 its ability of chondrogenesis is increased evidently in cultured by diplex growth factors (tgf and fgf).key words： bone mesenchymal stem cells； cellular carrier； chondrogenesis； tissue engineering骨髓干系胞（bone marrow stromal cells, bmscs）也 称骨髓的间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, bms

7、cs）, bmscs的提取分离及传代培养技术已逐渐成熟。如 何将bmscs种植于载体上进行体外人工培养形成软骨样组织 还是在探讨中的问题。本研究旨在探讨bmscs能否在体外几 种载体中提供软骨诱导微环境，促进bmscs向软骨分化并形 成组织工程软骨。1材料与方法1. 1细胞培养bmscs培养：抽取8周龄幼猪骼骨骨髓5 ml,用密度 梯度离心法分离出有核细胞，再以pbs缓冲液（gibco公司， 美国）和无血清dmem（gibco公司，美国）各离心洗涤1次。 制备含有0.05 u/ml青霉素、0. 05 u g/ml链霉素（gibco公 司，美国）、tgf 3 1 （sigma公司，美国）的浓度为

8、5 ng/ml. 10%胎牛血清（hyclone公司，美国）的dmem培养液。计数有 核细胞，以6x105个/cm2的密度接种于培养皿（gibco公司， 美国），置于37°c. 5%c02、饱和湿度的条件下培养，贴壁法 分离bmscs接种3 d后首次换液。待细胞生长达到80%90% 融合后，用0.25%胰蛋白酶+0. 02%edta消化，以1. 5x104 个/cni2的密度接种，常规传代扩增，第3代细胞用于实验。1.2载体制作、细胞种植及分析方法将无菌胶原蛋白海绵（fibrin collagen sponge , sigma公司，美国）、生物蛋白海绵（fibrin collagen

9、 sponge +bfgf,辽宁绿谷制药）、明胶海绵（gelatin sponge南京金 陵制药）在无菌条件下裁剪成5 mmx5 mmx5 mm方块状。a 组：胶原蛋白海绵;b组：生物蛋白海绵;c组：明胶海绵。 三组分别取16个标本，将第3代细胞按5x107个/cm2的密 度分别以载体内多点注射和表面点滴法接种到材料上，每块 材料接种细胞悬液300卩1。在371、5%c02、100%饱和湿 度下加含tgf p 1 （5 ng/ml,）的dmem培养液，每隔2d换 液1次，观察细胞增殖、细胞在支架材料上的黏附及细胞外 基质的分泌情况。培养4周取材进行组织学分析。利用细胞 直接技术法测定不同载体细

10、胞生长情况，即取免疫组化染色 的组织切片，选取三种不同载体构建的组织染色切片4张, 每张切片随机选取20个高倍视野进行直接阳性细胞计数, 然后组间比较mean±s. d. （n=4）应用spss 10.0软件进行 统计学分。2. 1细胞生长情况原代细胞呈集落样生长，培养57 d后可见均匀的 集落形成纺纟垂形或长梭形，类似成纤维细胞，但体积较小， 核仁12个，类似于既往文献报道的bmscs形态。传代后 细胞体积有所增大，有角状突起，增殖迅速，细胞接近融合 后呈“旋涡”样生长。接种到材料上后，细胞与胶原蛋白纤 维紧密黏附，分泌细胞外基质包埋纤维，基质逐渐增多填满 纤维间的空隙（图1、2）

11、o2.2大体观察b组标本体外培养2周后体积收缩，直径约为3 mm, 至4周直径为2 mm；而其他各组均维持直径在34 mm的范 围内。培养4周后，a、b组表面均光滑，细腻有光泽，形状 近似圆球形;c组表面粗糟，呈碎片状;b组标本呈灰白色， 同时有很好的硬度和弹性，而a组标本呈灰黄颜色，色较暗, 弹性和硬度不及b组。2. 3组织学、电镜观察2. 3. 1光镜检查 标本制备 标本经10%的福尔马林固 定，石蜡包埋切片，he染色，光镜观察，并采用免疫组化 sp法进行标记，所用ii型胶原试剂盒来自北京中杉金桥生物 技术有限公司。光镜结果：a组标本显示：淡紫蓝色软骨基质中见有 稀疏的软骨细胞组；可见软骨

12、陷窝样结构，陷窝周围可见蓝 染的细胞外基质成分;b组：淡紫蓝色软骨基质中见有软骨细 胞，多为单个散在，局灶几个细胞簇聚，细胞数量明显多于 a组，而且组织紧密，基质蓝染程度偏高。a组的组织学与b 组类似，其陷窝和细胞间的基质沉积较b组少。c组：见散 片状较细的胶原基质，未见细胞生长。利用spss 10.0软件统计学处理，显示b组软骨细胞阳性数量(92. 75±10. 57)多 于a组(36. 45±& 34),有统计学差异(p&lt；0.01)o两组都 明显多于c组(0),有统计学差异(p&lt；0.01)(图36)。2. 3.2电镜检查 透射电镜样品

13、制备：取培养组织1 mmx 1 mmx 1 mm大小，经2. 5%戊二醛前固定，1%餓酸后固 定，丙酮系列脱水，环氧树脂epon 812包埋，leiac超薄切 片机半薄切片定位后，再行超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双 重染色，jem-1010型透射电镜观察，摄片。图1、2第1代细胞呈集落形成纺缠形或长梭形，类 似成纤维细胞;2代后细胞体积有所增大，有角状突起，增殖 迅速，细胞接近融合后呈“旋涡”样生长图3、4 (a组)低 倍镜显示淡紫蓝色软骨基质中见稀疏散在的软骨细胞，高倍 镜见圆形透亮的软骨细胞(hex 100) (hex400)图5、6 (b 组)显示淡紫蓝色软骨基质中见成簇的的软骨细胞，软骨

14、基 质丰富(hex 100)；高倍镜显示细胞呈圆形或椭圆形，核深染(hex400)电镜结果：b组：软骨基质中见大量的胶原纤维，排列不规则。软骨陷窝内软骨细胞单个、4个、4个或多个存在，呈不规则形，表面有许多微小突起。细胞周边部可见 基质颗粒。细胞质较丰富，胞质内可见粗面内质网、高尔基复合体明显扩张，线粒体多见，少量脂滴。细胞核呈形或椭圆形(图7)。a组：软骨基质同一组，无明显改变，软骨 细胞多呈单个存在，少数为两个，细胞极不规则，突起增大， 突起表面有较大空白裂隙，细胞器没有b组发达，粗面内质 网、高尔基复合体没有明显扩张，细胞核异染色质增多（图 8）o2. 3.3免疫组化 标本经10%的福尔

15、马林固定，石蜡包 埋切片,he染色，光镜观察，并采用免疫组化sp法进行标记, 所用ii型胶原试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司。 a组：（图9）淡紫蓝色软骨基质中见有软骨细胞，多为单个 散在，局灶几个细胞簇聚（hex400）,软骨细胞较模糊，可 见单个肥大，胞膜不清，软骨基质ii型胶原（+）;b组：（图 10）淡紫蓝色软骨基质中见稀疏的软骨细胞（hex400）,软 骨细胞清晰，软骨基质ii型胶原（+）。图7 （a组-5000倍）软骨基质中见较多的胶原纤维， 软骨细胞多呈单个存在，少数为两个，细胞极不规则，突起 增大，突起表面有较大空白裂隙，细胞器没有e组发达，粗 面内质网、高尔基复合体没有

16、明显扩张，细胞核异染色质增 多图8 （b组-5000倍）软骨基质中见大量较细的胶原纤维， 有64 nm周期横纹，直径在1750 nm之间，排列不规则。 软骨陷窝内软骨细胞12个，呈不规则形，表面有许多微 小突起。细胞周边部可见基质颗粒。细胞质较丰富，胞质内 粗面内质网、高尔基复合体明显扩张，线粒体多见。细胞核 呈圆形或椭圆形（图12）。图9 （a组）淡紫蓝色软骨基质 中见稀疏的软骨细胞（hex400）,软骨细胞较模糊，软骨基 质ii型胶原(+)。图10 (b组)淡紫蓝色软骨基质中见有 多个软骨细胞，多为单个散在，局灶几个细胞簇聚 (hex400),软骨细胞较清晰，可见单个肥大，胞膜不清， 软骨

17、基质ii型胶原(+)3讨论3.1骨髓的间充质干细胞分离培养与分化骨髓的间充质干细胞(mesenchymal stem cells)又称 骨髓基质细胞(marrow stromal cells, mscs)属于成体干细 胞。因培养液、机械因素、生长因子等的不同，mscs可分化 为骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞等。 bmscs定向分化为软骨细胞的诱导因子是bmscs定向分化软 骨细胞的必要条件1。作者在分化mscs时，一部分采取抽 骨髓去除血细胞后加入细胞液培养，通过换液法去除其他细 胞，再以贴壁生长的细胞而收取mscs。此法虽然古老，但操 作简便，可以用较多的骨髓血获得足够的ms

18、cs。为了获取 mscs的高纯度，本组应用了密度梯度离心法分离出有核细 胞，经贴壁培养获得mscso应用已成熟和公认的成软骨培养 液，即dmem液，在tgf-b 1诱导下，培养两周分离转换至3 代，传代培养见细胞有角状突起，增殖迅速，细胞接近融合 后呈“旋涡”样生长，此时的细胞形态更接近于软骨细胞形 态。本组的实验证明，3代转换培养bmscs移植于细胞载体, 具有良好的分化软骨细胞能力。3.2软骨形成与细胞诱导剂的组合作用tgf-b 1作为诱导剂，它是一种生物活性极为广泛且 具有相对特异性的诱导因子。其可以促进软骨基质合成，能 够促进软骨细胞增殖和合成ii型胶原及蛋白多糖，还能使蛋 白多糖硫酸

19、化程度更高，更加符合软骨的生理特点；也能够 诱导多种间充质来源的干细胞向软骨细胞分化，维持b软 骨细胞的表型稳定。本实验各组从细胞分离培养到载体移植 均在tgf-b 1诱导因子下进行。a、b组结果显示有软骨细胞 形成oworster将不同浓度的tgf b 1 (010 ng/ml)与mscs 作单层培养后，细胞的层数和密度都增加，i、ii型胶原的 mrna含量在tgf-b1浓度为5 ng/ml时含量最高，说明 tgf-b 1能促进mscs成软骨分化，并有量效关系，最适浓度 为5 ng/ml 2。本实验的tgf- b 1浓度为5 ng/ml与以上相 同。tsutsumi等的研究显示，培养液中加入

20、fgf培养很多 代，mscs仍保持多分化的潜能。在10%fbs的单层培养中， fgf大大增加了兔和人mscs的生长率和生存时间。在体外扩 增mscs时，加入fgf(pgf+mscs)与未加fgf组相比较，扩增 后在成软骨培养液中行微球培养，其结果显示：fgf+组在微 球的表面出现球形软骨细胞，并被软骨特征性的蛋白多糖围 绕。说明了 mscs在体外扩增时加入fgf,维持了 mscs的成 软骨分化能力3 o mastrogiacomo等在分析各种生长因子促 mscs成软骨分化的研究显示，fgf是促进mscs增殖最有效 的生长因子4,可增加干细胞的软骨分化增殖和软骨基质 的形成，在维持软骨形态和防止

21、软骨细胞衰老退变方面起着 重要的作用，实验证明了 fgf单独或与其他生长因子联合应 用均可提高人mscs的成软骨能力57。本实验生物蛋白 海绵b组，其胶原蛋白吸附有b-fgf成分，并在细胞培养液 中具有tgf-b 1因子的双重作用下，其形成软骨的能力比a 组明显提高，组织切片中软骨细胞显示较多。电镜显示：软 骨陷窝内可见多个软骨细胞，细胞质较丰富，胞质内可见粗 面内质网、高尔基复合体明显扩张，线粒体多见，结果说明: fgf可激发mscs的成软骨分化能力。fgf与tgf-b 1组合应 用对mscs的成软骨分化能力明显增强。3.3纤维胶原蛋白海绵的细胞载体作用细胞在三维立体结构的载体中，才具有组织

22、形成的能 力。纤维蛋白凝胶作为细胞载体的组织工程形成，已有较到 多的文献报道，并证明了其是一种良好的细胞载体8,9 o 尽管将蛋白凝胶用注射法包埋或汇合细胞培养，但其凝胶性 易降解，不及细胞的生长速度，而将蛋白胶调和至理想的浓 度，才能促成细胞的生长和组织形成，但有一定的技术难度10。在细胞培养中，凝胶的阻隔作用，能否使细胞液很好 的渗透和足够的营养细胞，有待于质疑，而且，纤维凝胶的 支架力学作用不强，故不利于细胞的生长和生存11 o mukai da等12用ii型胶原海绵培养兔肋软骨细胞可以很好 地维持软骨细胞的表型，得出原代软骨细胞在胶原海绵上培 养时更适合临床和实验室的应用的结论。本实验

23、应用纤维胶 原蛋白海绵作为细胞载体，可提供细胞培养的三维立体结 构，相当于细胞的临时基质，有利于软骨细胞向软骨的有形 方向发展。纤维胶原蛋白海绵，具有良好的孔隙和吸附性， 便于细胞附着和细胞基质的黏附，是良好的细胞载体。本实 验将mscs细胞悬液多点注入纤维胶原蛋白海绵载体中，使 细胞分散均匀，加上海绵的多孔性和吸附性，细胞的附着和 营养液均匀渗透，利于细胞良好的生长和基质的合成。明胶 海绵孔隙较大，不利于细胞黏附，其降解速度较快，为了克 服其不足，有作者将明胶海绵透明质酸结合，增加了支架的 机械强度和细胞的黏附性，体外培养软骨细胞生长良好并分 泌了大量的ii型胶原基质13。本实验证明：明胶海

24、绵的吸 附力虽较强，但易崩解，在培养1周后出现散片状，对细胞 的生长不利。本实验证明：纤维蛋白胶原海绵作为mscs载体在 tgf-3 1和bfgf的双重作用下，其成软骨的能力明显增加。 tgf-b1在软骨细胞中的主要作用是合成代谢，刺激蛋白多 糖和dna合成，也有对软骨细胞分化的双向调节作用，而fgf 对软骨细胞分化有协同作用，从而促进软骨细胞增殖14 olazarus等人测量小鼠胫骨近端软骨肪板的不同区域的fgf 各型的表达，发现fgf在不同的区域各型的表达不同，fgf 可作用于靶器官，调节mrnas而影响软骨板的发育；在胚胎 早期，fgfrs 2 and 4表达较多，表示软骨化的成分较高1

25、5。 本实验利用tgf-b 1和fgf的双重作用于软骨形成，将mscs 种植于胶原蛋白海绵并在以上双重因子的培养形成了软骨。 鉴于胶原蛋白海绵已大量的应用于临床，可直接作为mscs 载体用于临床软骨损伤的修复。4结论mscs在体外可分离后在tgf-b 1培养液中可扩增，种 植于三维立体结构的纤维胶原蛋白海绵载体上，在含有 tgf2b 1培养液中形成软骨。mscs种植于纤维胶原蛋白海绵 载体后，在tgf-b1和fgf的双重培养中，其软骨的形成能 力明显增加。如将体外形成软骨植入体内可修复关节软骨， 可使mscs在软骨组织的修复中具有临床应用价值。【参考文献】1 mello ma, tuan rs

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