色谱柱故障排除及维护手册

1、目录1目的12适用范围2第一章：气相色谱柱21.气相色谱柱介绍21.1聚硅氧烷21.2聚乙二醇32 气相色谱柱选择32.1相似相溶原理是首要指导方针32.2特殊样品需要用特殊柱子分析42.3必要时需用不同极性的柱子对目标物进行对比分析42.4色谱柱参数对分离的影响43 气体系统53.1气源纯度选择53.2气体过滤器的使用与更换53.3气体管路的材质与检漏64色谱柱的安装65 气相色谱柱的清洗66 气相色谱柱的老化77 气相色谱柱的保存78色谱柱污染89毛细管色谱柱常见问题的解决89.1峰丢失（进样后没有峰出现）的原因：89.2前沿峰的原因：99.3 拖尾峰的原因：99.4只有溶剂峰的原因：99

2、.5宽溶剂峰的原因：109.6 假峰的原因：109.7 过去工作良好的柱出现未分辨峰的原因：109.8 基线不规则或不稳定的原因：109.9 同一根柱保留时间长短不一的原因：111色谱柱的类型11常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶、离子交换树脂、凝胶或玻璃微球等填充剂。在化学键合硅胶中以十六烷基硅烷键合硅胶最常用,辛基硅烷键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用。近年来,由于蛋白质等生物大分子物质分离提纯技术的飞速发展,离子交换色谱柱、凝胶色谱柱的应用也越来越广。113.2高效液相色谱柱的选择123.2.1申购前怎样选择填料粒度123.2.2 如何保证良好的柱性能与柱寿命要做到以下几点：1

3、24 色谱柱的管理13每一根新购进的色谱柱必须造册登记,内容包括:生产公司、品名、型号、规格、购进时间、启用时间、单价、柱内保护溶液等。13每启用一根新色谱柱,在色谱柱上贴上标签,注明启用日期。每根柱子每两个月保养一次,特别是对于一些使用频率少的柱子,因为放置时间长,容易干柱,每一次做好保养记录。13对于确已失效的柱子,做好停用记录,不能随意丢弃,专门存放,如果现用的柱子的填料需要填补,只要柱子类型相同，可以用存放的柱子的填料修复有缺陷的色谱柱。134.1 建立HPLC色谱柱的技术档案134.2 色谱柱到货验收134.3 新色谱柱注意事项145 影响色谱柱使用寿命的因素145.1 样品的制备与

4、预处理。145.2 选用合适的流动相145.3 正确操作HPLC仪器。156 色谱柱的维护和保养166.1 色谱柱的安装与拆卸166.2 色谱柱的维护与平衡176.3 色谱柱清洗、再生和保养186.3.1 液相色谱柱清洗186.3.2 高效液相色谱柱的再生195.3.3 色谱柱的保存206 色谱柱的故障排除216.1 液相色谱柱常见问题的解决216.2 柱塌陷的处理247 色谱柱使用的注意事项258 保护柱的选择使用26色谱柱故障排除及维护手册1目的在高端仪器检测分析过程中，色谱柱是关键部件之一，在分析中起着至关重要的作用，它是色谱仪器的核心。在分析中峰形的对称性会直接影响到定量的准确性。正确

5、使用、维护色谱柱，不但能保证色谱分离与分析高效、高灵敏和快速进行，提高准确性与重现性，而且对延长色谱柱的寿命、保持长期稳定的工作具有重要的作用，因此，延长色谱柱的寿命无疑对节省投资、降低成本有重大意义。更便于各实验室对色谱柱的管理、使用、故障及时排除等查阅使用。2适用范围本手册适用于具备液相、气相类仪器的实验室。第一章：气相色谱柱1.气相色谱柱介绍通常来说，一根毛细管色谱柱由两部分组成：管身和固定相。管身一般使用熔融二氧化硅或不锈钢作为基本材质：而固定相种类就有许多了。大部分的固定相是液体或胶状的高分子量，具有高热稳定性的聚合物，最常用的是聚硅氧烷（有时误称为硅氧烷）和聚乙二醇，另外还有一类是

6、小的多孔粒子组成的聚合物或沸石(例如氧化铝、分子筛等)。色谱柱管熔融二氧化硅即高纯度合成石英（以下通称熔融石英)，通常在其表面涂上一层聚酰亚胺做为保护层。涂层后的熔融石英毛细管呈褐色：但是涂层后的毛细管之间的颜色却不尽相同。色谱柱的颜色对于其色谱性能没有什么影响。经过持续的较高温度处理后聚酰亚胺涂层管的的温度会变得比以前更深：标准的聚酰亚胺涂层管熔融石英管的温度上限为360，高温聚酰亚胺涂层管的温度上限为400。1.1聚硅氧烷聚硅氧烷在其用途的多用性、性质的稳定性上都有优良的表现也是目前最为常用的固定相。标准的聚硅氧烷是由许多单个的硅氧烷重复联接构成：每个硅原子与两个功能基团相连，功能基团的类

7、型和数量决定了固定相总体类型和性质常见的四种功能基团为甲基、氰丙基、三氟丙基和苯基。最基本的聚硅氧烷是由100%甲基取代的。1.2聚乙二醇聚乙二醇是另外一类广泛应用的固定相。有些我们称之为“WAX”。聚乙二醇不象聚硅氧烷那样有多种取代集团，它是 100%固定基质的聚合物。相对于聚硅氧烷，聚乙二醇固定相色谱柱的寿命较短，而且容易受温度和环境（有氧环境等）的影响。另外，聚乙二醇固定相在相应的GC实验条件下需保持液态。但由于其独特的分离性能，聚乙二醇仍是我们常用的固定相之一。常用的聚乙二醇GC固定相有两种，一种是能在较高温度下使用的，但是它的活性相对较高一些（也就是说有些化合物的色谱峰会有拖尾现象）

8、。另一种的使用温度上限较低，温度下限也较低，但使用中所表现出的再现性和惰性比上一种要好。在分离指数上，上述两种固定相有轻微的差异。还有一种是 pH 阳离子改性聚乙二醇固定相。FFAP 柱就是一类用对苯二甲酸改性的聚乙二醇作为固定相的。这种色谱柱常用于分析分离酸性化合物。另外，我们也用碱性化合物对聚乙二醇固定相改性用来分析分离碱性化合物（CAM）。2 气相色谱柱选择目前，市场上出售的商品毛细管柱品种、 规格、牌号繁多，这给使用毛细管柱的分析人员带来一定困难。其实各供应商产品相互可以替代，不一定要追求某一特定的商品牌号。色谱柱的选择是整个色谱分析条件优化过程中最重要的一环， 色谱柱选择得是否恰当直

9、接决定了分析结果的准确性、数据的重现性、峰型的美观等等。目前，气相色谱中使用的色谱柱分为填充柱和毛细管柱两大类。从使用范围来看，毛细管柱更广泛一些，但并不意味着填充柱不重要，比如一些永久性气体的分析、水分的测定等还必须用填充柱来做。简单说就是各有各的应用范围。下面简述毛细管柱使用时的一些注意事项。2.1相似相溶原理是首要指导方针在选择柱子的时候根本的原则是相似相溶，简单说就是分析非极性物质用非极性的柱子，分析极性物质用极性的柱子。相似相溶的道理比较简单，被分析物和固定液之间作用的次数越多，理论塔板数就越大，柱效也就越高，有助于难分离组分的分离，同时峰的对称性也较好； 如果被分析物和固定液之间没

10、有作用力，或者作用力很弱， 即几乎不保留，这时几乎不可能有分离，所有组分都死时间出峰，这不是我们的目的。因此，选择柱子一定要先对分析物的极性有个大致的判断，根据相似相溶的基本原理进行选择。选择不当结果差异很大。2.2特殊样品需要用特殊柱子分析在为很多新项目研发做分析工作时，经常会遇到一些奇特的样品，根本没有任何标准可以参考，都得自行摸索。经常会遇到一些常用柱子无法分析的项目，比如胺类物质、杂环化合物等等。由于这些物质多少都有碱性，对常规柱子伤害较大，且做出来的结果可靠性、峰型等不确定因素较多，因此对这类样品应该选择针对性较强的柱子。此时选择柱子最好的办法就是多查阅相关资料、文献，再加上适当的实

11、验摸索，才能选到合适的分析柱。2.3必要时需用不同极性的柱子对目标物进行对比分析对于多组分的反应液，仅仅靠一根柱子，存在有些杂质和目标峰没有分开(或者完全包在主峰里面)的问题，因此采用不同极性柱分析， 做出来的结果进行对比可以有效地避免类似的情况发生。如果二者不一致，需结合其他定性手段综合分析，决定柱子的选择。这需要多摸索、多实践、多积累来完成。2.4色谱柱参数对分离的影响毛细管色谱柱的参数主要包括四个方面: 固定液极性、柱长、内经、膜厚等。根据固定液极性的强弱可以分为非极性柱 (DB - 1或者等同的 其它品牌)。弱极性柱(DB -5或者等同的其它品牌)、中等极性柱 (DB -17或者等同的

12、其它品牌)、强极性柱(DB-WAX或者等同的其它品牌)。在选择柱子的时候应该根据样品本身极性的强弱依据相似相溶原理进行选择。对于非极性物质，一般选用非极性固定液。此时各组分按沸点顺序分离 , 沸点低的先流出。同系物则按碳数顺序流出 , 低沸点或低分子组分先流出。对于中等极性物质选 用中等极性 固定液。组分基本上按沸点顺序流出。若是极性与非极性的混合物 , 则非极性组分先流出。对于强极性物质，通常选用强极性固定液。各组分流出顺序按极性大小排列，极性小的先流出，极性大的后流出。柱长对分离的影响也很明显通常柱子越长，分离效果越好，但是保留时间增加的也很明显，这本身是个矛盾，需要找到一个平衡点。对于特

13、别难分离的物质，一般可以选用长柱子。内径对柱容量和柱效有较大的影响，内径越小，柱效会变高，但柱容量会下降，这个参数选择的空间不是很大。膜厚是一个选择空间比较大的参数，通常膜厚越厚，对分析物的保留会增加，保留时间增大，有助于分离；但是由于传质阻力的增加，柱效会降低。因此，如果分析的是保留弱的物质(比如一些小分子)，可以考虑厚液膜的柱子；反之则选择薄液膜的柱子。3 气体系统3.1气源纯度选择选择气体纯度时，主要取决于三个因素：分析对象、色谱柱类型、检测器类型，即：微量分析比常量分析要求高，毛细管柱比填充柱要 求高，浓度型检测器比质量型检测器要求高。火焰离子化检测器(FID)、 电子捕获检测器(EC

14、D)的载气(氮气)纯度99.998% ，燃气氢气的纯度99.995，助燃气空气的纯度达到呼吸级。一般建议在满足分析要求的前提下，尽可能选择纯度较高的气体。安捷伦、瓦里安等厂商均提出使用纯度99.999%高纯气体的建议，以保持仪器的灵敏度及延长色谱柱寿命 。3.2气体过滤器的使用与更换通常建议在FID的载气和尾吹气、空气和氢气管线上安装烃类过滤器，在ECD的载气和尾吹气管线上安装氧气和水分过滤器。气体过滤器的安装位置离色谱仪越近越好，各种过滤器的安装顺序次为：水分过滤器、烃类过滤器、氧气过滤器。气体过滤器应适时更换，以免成为污染源 。3.3气体管路的材质与检漏塑料管线通常存在渗漏问题，所以最好采

15、用质量可靠的铜管或不锈钢管，并定期用体积比为1:1的异丙醇水溶液检查管线接头。安装新管线后，先用高纯氮吹扫，再接气体过滤器 。4色谱柱的安装气相色谱柱安装色谱柱时应正确选择密封压环的材质及其孔径。ECD必须使用石墨/聚酰亚胺混合的密封压环。内径为0.5、0 .32和0 .5 3 m m 的色谱柱分别选择孔径规格为0.4、0.5和0.8 mm 的密封压环。切割色谱柱时，确保切割面平整，不可出现斜切面或锯齿面。每次更换不同规格尺寸的色谱 柱后，务必在仪器控制面板上设定安色谱柱长度和 孔径参数，然后按enter键，等待仪器重新初始化后数值得以更新。王珂等报道说,由于实际使用的色谱柱内径为250um，

16、而仪器控制 面板上的设定值为320um，导致色谱峰保留时间改变、重复性变差 。5 气相色谱柱的清洗首先，污染的气相色谱柱最容易的补救方式是通过切除前端盘绕的色谱柱（大约50cm）。如果污染物位于柱子前端，那么色谱柱的性能会立即得到改善。如果柱性能没有得到改善，则可以判定污染物没有位于柱子的前端。气相色谱柱固定相如果是化学键合性质的也可以进行溶剂冲洗，色谱柱是安全的。并不破坏键合型固定相。不过，要避免在Carbawax或DB-Wax这样的腊质性固定相上用甲醇和水作溶剂冲洗。最佳方式是采用一组溶剂依次进行柱冲洗。通常，最佳溶剂组为10ml甲醇，10ml二氯甲烷和10ml正己烷溶剂。如果必须用水去除

17、盐类的话，那么在用甲醇冲洗之前，先用10ml水进行冲洗。冲洗的方式是按照正常载气流速的反方向，从检测器端至进样口端方向进行冲洗。在所有冲洗结束之后，色谱柱重新使用之前，要用氮气通过柱子吹干30min-40min。在柱子加温之前，要用载气慢速吹干以防止损害固定相。目前，这种柱冲洗装置已市场销售，其价格不比一根新色谱柱贵。冲洗柱子是去除污染物的最佳方式，但一般情况下，绝大多数人还喜欢选择高温老化方式去除柱内污染物。因为高温老化比较简便，因此也是一种去除污染物的有效方法。不过应注意，高温老化色谱柱也不是经常有效的，因为它仅仅去除挥发性和半挥发性组分。如果污染物粘附在进样口或污染物是非挥发性的，那么长

18、期高温老化色谱柱则难以解决这一问题6 气相色谱柱的老化老化色谱柱时，在50通载气20分钟，再以5/min缓慢升温至老化温度，恒温2小时。一般老化23遍 即可，旧色谱柱老化时，进样有机溶剂有利于残留组分的流出。色谱柱的老化温度一般为高于样品分析终温20，但不超过色谱柱的恒温上限。老化色谱柱时，勿将柱末端接在检测器上 ，检测器用无孔螺帽封堵。FID允许接色谱柱老化，但检测器温度必须升至300方可运行老化程序 。7 气相色谱柱的保存高温、载气中微量的水汽和氧、化学损伤、被污染是影响柱寿命的主要因素。要延长色谱柱的寿命，应尽量使用高纯度气源、安装并定期维护气体捕集阱、对管线定期检漏、开机时在色谱柱低温

19、状态下通载气20分钟；选用优质的密封材料；在满足要求的情况下选择较低的使用温度；样品处理要“干净”，减少高沸点杂质组分；分析比较“脏”的样品时使用预柱或选择填有玻璃棉的衬管；色谱柱长期不用时，从仪器上拆下并封堵两端保存，同时标注色谱柱的进样口端或检测器端 。8色谱柱污染尽管固定相的化学损伤是不可补救的，但在实际中可以去除绝大多数污染物，使色谱柱获得功能性恢复。通常，色谱工作者涉及两种类型污染，第一种不能洗脱的非挥发性物质；第二种最终能从柱子洗脱出来的半挥发性物质。柱子污染的症状为，产生吸附，出现鬼峰、脱尾峰、前延峰，发生分解，造成柱固定相过度流失和柱选择性改变。潜在的污染源包括：注射的样品、橡

20、胶隔膜和金属垫碎屑、载气和捕集器中杂质以及其它来自外部如器皿和注射器中的杂质。污染的气相色谱柱的功能恢复有一些容易解决的方法。首先，也是最容易的补救方式是通过切除前端盘绕的色谱柱（大约50cm）。如果污染物位于柱子前端，那么色谱柱的性能会立即得到改善。如果柱性能没有得到改善，则可以判定污染物没有位于柱子的前端，下一步骤就是清洗进样系统。进样口石英衬管将是造成柱子污染的主要原因，要及时更换清洗。如果进样口石英衬管没有污染，而且污染物又不位于柱子的前端，那么，可以判定整个柱子的固定相遭到严重污染。气相色谱柱冲洗柱子通常需冲洗装置和有经验者进行，此处不做描述。一般情况下，绝大多数人还喜欢选择高温老化

21、方式去除柱内污染物。因为高温老化比较简便，因此也是一种去除污染物的有效方法。不过应注意，高温老化色谱柱也不是经常有效的，因为它仅仅去除挥发性和半挥发性组分。如果污染物粘附在进样口或污染物是非挥发性的，那么长期高温老化色谱柱则难以解决这一问题。事实上，高温老化色谱柱所带来的弊病远远大于解决这一问题获得的好处。如果污染物是活性和非挥发性的，那么长期高温老化色谱柱则会缩短柱子的使用寿命。9毛细管色谱柱常见问题的解决9.1峰丢失（进样后没有峰出现）的原因：（1）注射器有毛病，采用新注射器做验证；（2）未接入检测器或检测器不起作用，检查设定值；（3）进样温度太低，检查温度，并根据需要调整；（4）柱温温度

22、太低，检查温度，并根据需要调整；（5）无载气流量，检查压力调节阀，并检查泄露，验证柱样品流速；（6）柱断裂，如果柱断裂是在柱进样口端或检测器末端，是可以补救的，切去断裂部分，重新安装。9.2前沿峰的原因：（1）柱超载，减少进样量；（2）两个化合物共洗脱，提高灵敏度和减少进样量，使温度降低1020，以使峰分开；（3）样品冷凝，检查进样口和柱温，如有必要可以升温；（4）样品分解，采用失活化进样器衬管或调低进样器温度。9.3 拖尾峰的原因：（1）进样器衬套或柱吸附活性样品：更换衬套。如解决不了就将柱进样端截12cm，再重新安装；（2）柱或进样器温度太低：升温（不要超过柱最高使用温度）。进样器温度应比

23、样品最高沸点高20；（3）两个化合物共洗脱：提高灵敏度和减少进样量，使温度降低1020，以使峰分开；（4）柱已损坏：请更换柱；（5）柱污染：将柱进样端截去12cm，再重新安装。9.4只有溶剂峰的原因：（1）注射器有毛病：采用新注射器验证；（2）不正确的载气流速（太低）：检查流速，如有必要，调整之；（3）样品浓度太稀：请提高仪器灵敏度，或增加注入量；（4）柱箱温度太高：检查温度并根据需要调整；（5）柱不能从溶剂中分离出组分：更换高膜厚的色谱柱或不同极性；（6）栽气泄露：检查泄露处（肥皂水）；（7）进样器衬套或柱吸附活性样品：更换衬套。如解决不了就将柱进样端截去12cm，再重新安装。9.5宽溶剂峰

24、的原因：（1）由于柱子安装不当，在进样口产生死体积：重新安装柱；（2）进样技术差（进样太慢）：采用快速平稳进样技术；（3）进样器温度太低：提高进样器温度；（4）样品溶剂与检测相互影响二氯甲烷/ECD：更换样品溶剂。（5）柱内残留样品溶剂：调整或清洗；（6）隔垫清洗不当：调整或清洗；（7）分流比不正确分流排气流速不足：调整流速。9.6 假峰的原因：（1）柱吸附样品，随后解吸：更换衬管，如不能解决问题，就从柱进样口端去掉12圈，再重新安装；（2）注射器污染：用新的注射器及干净的溶剂试一试，如假峰消失，就将注射器冲洗几次；（3）样品进样量太大：减少进样量；（4）进样技术太差、进样太慢：采用快速平稳的

25、进样技术。9.7 过去工作良好的柱出现未分辨峰的原因：（1）柱温不对：检查并调整温度；（2）不正确的载气流速：检查并调整流速；（3）样品进样量太大：减少样品进样量；（4）进样技术水平太差（进样太慢）：采用快速平稳进样技术；（5）柱和衬套污染：更换衬套，如不能解决问题，就从柱进口端去掉12圈，并重新安装。9.8 基线不规则或不稳定的原因：（1）柱流失或污染：更换衬套。如不能解决问题，就从柱进口端去掉12圈，并重新安装。（2）检测器或进样器污染：清洗检测器和进样器;（3）载气泄露：更换隔垫，检查柱泄露;（4）载气控制不协调：检查载气等气源压力是否充足。如压力500psi，请更换气瓶;（5）载气有杂

26、质或气路污染：更换气瓶，使用载气净化装置清洁金属管;（6）载气流速不在仪器最大/最小限定范围之内（包括FID用氢气和空气）：测量流速，并根据使用手册技术指标予以验证;（7）检测器出毛病：参照仪器使用手册进行检查;（8）进样器隔垫流失：老化或更换隔垫。9.9 同一根柱保留时间长短不一的原因：（1）柱温太低或太高，检查冰并调节柱温;（2）载气流速太高或太低，在柱出口处用适当的，经标定气源测量流速;（3）进样器隔垫或柱泄露，如必要，请检查并修复;（4）柱污染或损坏，重新老化或换柱;（5）样品超载，减少进样量;（6）记录仪出毛病，检查记录仪;（7）载气控制不协调，检查载气源，看压力是否足够,如压力50

27、0psi，请更换气瓶。第二章：液相色谱柱1色谱柱的类型常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶、离子交换树脂、凝胶或玻璃微球等填充剂。在化学键合硅胶中以十六烷基硅烷键合硅胶最常用,辛基硅烷键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用。近年来,由于蛋白质等生物大分子物质分离提纯技术的飞速发展,离子交换色谱柱、凝胶色谱柱的应用也越来越广。3.2高效液相色谱柱的选择3.2.1申购前怎样选择填料粒度目前，商品化的色谱料粒度从1um 到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高；在相同选择性条件下，提高柱

28、效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30；然而，3um的色相谱的背压却是5um的2倍。3.2.2 如何保证良好的柱性能与柱寿命要做到以下几点：（1）认证阅读色谱柱使用说明书；（2）使用填充良好的色谱柱；（3）尽量减少压力波动，避免机械及热冲击；（4）使用保护柱及在线过滤器；（5）经常以强溶剂冲洗色谱柱；（6）充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；（7）用稳定的固定相(C18最稳定)；（8）在中等PH值操作(68)，用有机缓冲溶液；（9）色谱柱使用温度最好

29、小于40；（10）硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.08.0；（11）在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；流动相中含有缓冲溶液，应注意应95：5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5 ；（12）过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存(乙晴最好)。4 色谱柱的管理每一根新购进的色谱柱必须造册登记,内容包括:生产公司、品名、型号、规格、购进时间、启用时间、单价、柱内保护溶液等。当我们接到一根新的色谱柱时，使用前应先检查产品包装、外观是否完好，是否配备产品说明书或性能测试报告。认真阅读产品说明书及性能测试报告，了解新柱子的最佳性能指标，如某色谱条件下的柱压、

30、柱效等；了解使用范围及最佳适用的实验条件，并建立该色谱柱的技术档案。每启用一根新色谱柱,在色谱柱上贴上标签,注明启用日期。每根柱子每两个月保养一次,特别是对于一些使用频率少的柱子,因为放置时间长,容易干柱,每一次做好保养记录。对于确已失效的柱子,做好停用记录,不能随意丢弃,专门存放,如果现用的柱子的填料需要填补,只要柱子类型相同，可以用存放的柱子的填料修复有缺陷的色谱柱。4.1 建立HPLC色谱柱的技术档案色谱柱的技术档案包括：生产厂家、柱编号、填料类型、购进时间、启用时间、保护液名称等。厂方提供的性能测试报告。诸如生产日期 填料名称、粒度、形状、表面积、孔穴直径 柱管材料及尺寸、柱效、以及测

31、定柱效用的样品组成与色谱分离条件，计算公式及附带的色谱图等。4.2 色谱柱到货验收通常根据厂方提供的技术指标在同样的色谱条件下，采用相同的样品与浓度进行测试，观察实测结果是否与厂方提供数据吻合。若检验合格，实测数据是今后使用过程中柱性能是否下降的基准；若检验不合格，那么实测数据是与厂方交涉的重要技术依据。如果没有厂家说明书（证书）指定的样品时，可使用具体检测项目的标准品进行验收色谱柱，判定标准？验收过程中一定要记录保存色谱柱的一些性能指标，如柱效、柱压、死体积V等，供今后参考。4.3 新色谱柱注意事项新柱有时分析用的流动相与柱子的保存试剂不同，故在分析样品之前，应使用合适的试剂将柱子中的保存试

32、剂清洗出来，要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18柱通过出厂测试后多保存在乙腈中，可用1020倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高，如开始0.30.5mLmin，1O15min后可慢慢加快。硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需要使用含水的流动相，则使用前须用乙醇或异丙醇冲洗，流速0103mLmin，将正庚烷冲洗干净后，再用流动相平衡。5 影响色谱柱使用寿命的因素5.1 样品的制备与预处理。 许多样品，尤其是生物与环境样品，往往组份复杂，不经制备与预处理就无法直接进行分析。所以，样品制备与预处理是影响色谱柱性能与寿命的关键。通常必须包括下列步骤

33、：（1）将样品溶于与色谱系统相适的溶剂中。这类溶剂不仅对样品具有较大的溶解度，而且要与流动相互溶其强度要低于流动相或梯度洗脱中的起始流动相，以免影响样品分离。此外，还要与色谱系统其他部份如高压泵、进样器、检测波长、固定相填料类型等相适用。（2）用微孔滤膜除去直径0.2um以上的不溶微粒，以免堵塞柱头滤片及柱内填充床，使柱压降升高。（3）除去样品中干扰分离或分析及影响色谱柱性能的基质和其他组份（如强酸、强碱性物质和蛋白质之类的生物大分子等）。5.2 选用合适的流动相流动相的性质与纯度不仅影响分离与测定，而且会涉及色谱柱的性能与寿命。通常分析纯的溶剂含有微量杂质，作为流动相大量使用后会引起柱性能变

34、化。因此，最好采用HPLC级溶剂。使用的水和其他溶剂越新鲜越好。采用混合溶剂时，要现用现配，用多少配多少。使用无机盐缓冲液时，配好的溶液要经再经过045或0.22um薄膜过滤后使用，配好溶液要当天用完，实在用不完的必需保存在4的冰箱内，但不宜过久，以免微生物滋长。流动相的pH值对色谱柱极重要。以硅胶作基质的固定相一般只允许在2<pH<7.5范围内使用,即使如此，它们长期在pH：>7使用时，硅胶会逐渐溶解。而高分子基质的固定相受pH影响不如硅胶基质的大，允许使用的pH范围要宽得多，特别适合于缓冲液体系 但不同溶剂会引起填料的溶胀与收缩，使柱内填充床产生缝隙，死体积改变，甚至破坏

35、颗粒的结构，影响柱性能等问题，必需特别注意。5.3 正确操作HPLC仪器。HPLC仪器种类虽多，但主要部件基本相同，因此对色谱柱的影响也相差无几。5.3.1色谱柱与色谱系统要合理配置。规格不同的色谱柱要求用不同的连接系统，若不配套会引起严重的柱外效应，使峰变宽、分离度下降。对保留时间短的组份影响尤为严重。 色谱仪运行时，各部件的自然损耗不可避免地对色谱柱产生影响。高压泵中柱塞往复运动与密封圈不停地磨擦，形成粉末随流动相流出，极易损害进样阀、堵塞色谱柱头，造成柱压降升高，柱效受损。进样阀在高压下工作时也易磨损阀芯，产生粉末堵塞柱头。5.3.2 操作不当对色谱柱的影响 这里涉及的操作不当不是指明显

36、的使用差错，而是指那些常为人们忽视的似乎正确实不恰当的操作方式。它们包括：（1）进样阀操作不当。进样阀从“装样转动”到“进样”位置时，由高压泵输送进入色谱柱的流动相会发生0.2秒左右的中断，引起柱压的改变，产生所谓“压力波 (Pressure shock)。所以转动进样阀要越快越好，对手动进样尤为重要。 （2）大体积进样。由于常压下液体样品输入柱内会经受由常压到系统高压的变化过程，体积越大，过程经历时间越长，压力波也越大，从而影响到柱性能的变化。（3）系统的渗漏与污染。如高压泵柱塞、单向阀的渗漏与污染也会产生压力波动。即使有些仪器上有稳压器或压力阻尼装置，但这类装置无助于稳定大幅度的压力波动。

37、（4）溶剂脱气不足或溶剂槽内过滤头堵塞，造成高压泵在吸液过程中部份真空，使溶解在流动相内空气逸出、形成气泡，从而产生压力波动。（5）乱用连结管道与色谱柱之间的接头与垫圈。不同厂商生产的管道及色谱柱的接头和垫圈都不相同，不能通用，务必注意否则乱用垫圈不但使接头的密封性能受损，而且会影响与之接触的另一部件。（6）连接管道切割的断面不平整光精，内外缘有毛刺。不但会在连接处产生多余的死体积、产生多种 记忆效应，影响柱的分离性能，而且会生成金属粉末，堵塞管道与柱头。6 色谱柱的维护和保养6.1 色谱柱的安装与拆卸 高效液相色谱柱的安装是一项经验性很强的工作，在安装之前一定要仔细清洁密封卡套和接头端面，不

38、能残留固体颗粒,要保证管道端面与柱头端面的良好结合，不能留有死体积, 安装色谱柱要严格按照下列步骤:(1)拆卸下色谱柱人口处的密封螺丝观察是否有溶剂渗出：(2)如有溶剂渗出即可将色谱柱接到管路上，以避免气泡的进入：(3)如无溶剂渗出时，表明色谱柱的此端已经进去空气了，此时，可将色谱柱的出口端接到进样阀上，以流动相来反方向冲洗色谱柱，以便将柱内的空气排除。(4)如果流出的溶剂里不含有气泡，说明柱内的气体已经被排出了，再将色谱柱以正确的方向接好，这样气泡就进不到色谱柱里面了。目前多数在用高效液相色谱仪柱前流路系统为金属材质，柱接头采用固定板手紧固，在紧固螺母时不要一下用力过猛，防止锥形卡套卡死在阴

39、接头内无法取出。为避免这种现象，有些厂家(如安捷伦公司)已使用有固定接头的PEEK管代替金属管，用手动紧固代替板手紧固，但要特别注意接头尺寸(口径和接口深度)的匹配。接头等组件不要拧的过紧，适当上紧后开机试验，以恰好不泄漏为宜，防止用力过大而导致管道变形或用力不足而发性泄漏。色谱柱的装卸与密封。通常用手拧至不动时，再用扳手拧14圈即可，若此时仍漏，可在垫圈上缠聚四氟乙烯薄膜。薄膜缠绕方向要与螺丝拧动方向相反。卸开色谱柱时，若薄膜面在柱头内一定要取出，以免下次装柱堵塞柱头。6.2 色谱柱的维护与平衡柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。使用的流动相要与色谱柱存储溶剂相溶。在0.1mLmin的

40、流速下用流动相(一般100甲醇或乙腈)冲洗色谱柱子，在5min内将流速提高到1mLmin，当流动相均匀的从色谱柱子出口流出，停掉流速将色谱柱子出口端接检测器，再重复前面方法，流速由低到高，一旦达到稳定值且基线平稳，色谱柱平衡过程结束。当改变流动相时，应将新流动相的流速缓慢升高(最好每次0.1mLmin的升幅)，至少用10倍柱体积的流动相平衡色谱柱直到基线平稳。对于含甲酸盐的流动相(甲酸铵、甲酸等)，色谱柱平衡时间要适当延长。在进样器与色谱柱之间安装与色谱填料组成和颗粒大小匹配的保护柱。6.3 色谱柱清洗、再生和保养6.3.1 液相色谱柱清洗是日常的重要维护工作，如果样品分子残留在柱子、接头、流

41、通池中，会污染系统，影响对其它样品的分析，降低柱效。因此分析工作结束后，要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。6.3.1.1 在反相系统中常规清洗若流动相中无酸、碱、盐类物质，可用10O %甲醇冲洗3060min。若含酸、碱、盐类物质，则要先用10%甲醇（乙腈）和90%水，冲洗3060min，再用（5070 ）%甲醇（乙腈）冲洗，最后用100%甲醇（乙腈）冲洗。最好不要用100%纯水冲洗柱子。6.3.1.2 蛋白质污染后的清洗: 蛋白质对于RPLC固定相的污染是一类常见问题，一般情况下，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很好溶解多肽和蛋白质，因此不能有效地清洗柱子。可以用20倍柱体积的1乙酸水溶液、1%

42、三氟乙酸、0.1三氟乙酸正丙醇(40：60)、三乙胺正丙醇(40：60)、二甲基亚砜一水或二甲基甲酰胺(50：50)等以0.20.5 ml/min的流速隔夜清洗，然后置换到常规流动相体系中,常常可达到较好的效果。6.3.1.3 残留金属离子的清洗:考虑到N,N二甲基甲酰胺(DMF)具有黏度小，能与水和大多数有机溶剂以及许多无机液体混溶的特征，以其为冲洗剂，与丙酮结合进行色谱柱的再生(每种至少20倍柱体积)。只需要依次用N,N二甲基甲酰胺、丙酮清洗反相色谱柱然后用色谱纯甲醇过渡一下，就能达到较好的再生效果。不同型号色谱柱冲洗所用溶剂体积见下表1。色谱柱尺寸（mm）柱体积（mL）溶剂体积（mL）1

43、25×41.630250×43.260250×1020400表1 :色谱柱冲洗溶剂体积6.3.2 高效液相色谱柱的再生 因为高效液相色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，当出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰时，一般来说可能是柱效下降。若色谱柱柱效严重下降，分离效果变差，可以用10%异丙醇甲醇冲洗色谱柱。若柱效仍无改善，可以对色谱柱进行再生。6.3.2.1 反相柱的再生（非极性固定相(如反相色谱填料C18，C18，CN 等)）采用以甲醇：水=90：10(vV) 纯甲醇（二氯甲烷）乙腈异丙醇等溶剂作流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱的量为2030倍色谱柱

44、体积然后再以相反顺序冲洗色谱柱。当其被严重污染时，可依次用二甲基甲酰胺（二甲基亚砜(DMSO)）丙酮乙酰丙酮甲醇冲洗20倍柱体积，然后再以相反顺序冲洗色谱柱,能得到较好的效果。5.3.2.2 正相柱再生（极性固定相(如Si，NH。，Diol基色谱填料）顺次以（正己烷异丙醇正己烷甲醇）作流动相冲洗色谱柱，每步注意平衡溶剂的顺序不要颠倒，每种流动相流经色谱柱的量为2O一30倍柱体积(因异丙醇的粘度较大，冲洗过程中请随时注意调整冲洗的流速)，用甲醇冲洗完后，再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必需严格脱水。5.3.2.3 离子交换柱的再生 长时间在高pH值和高离子强度缓冲溶液中使用，将导致色谱柱

45、离子交换能力降低。用稀酸缓冲溶液冲洗，可使阳离子柱再生；反之，用稀碱缓冲溶液冲洗，可使阴离子柱再生。以上色谱柱的再生方法并不是绝对的标准方法，使用者可根据自己的实际经验和目的，选择合适的并能溶解柱内污染物的溶剂作流动相，按正方向或反方向的冲洗。但是需要指出是，无论采用什么方法再生色谱柱，均不可能完全恢复柱效或其他参数至新柱水平。另外，大多数强保留污染物都会累积在柱头上，对柱子反冲可以缩短冲洗时间。当然还要看所用色谱柱是否允许反冲。无论正冲还是反冲，最好不要接检测器，以免污染物进入检测池。污染物的过多累积会加大清洗难度，清洗柱子频率越高越容易清洗，所以有规律地清洗柱子，可以预防重大问题的发生。可

46、以将柱头入口处被污染的填料取出，重新补装同类型的填料，然后再改变柱流向进行再生。这种逆流再生方法，可以使大多数柱子性能得到恢复。5.3.3 色谱柱的保存5.3.3.1 高效液相色谱柱的保存柱子使用完后不要马上卸开，应彻底冲洗干净。如果色谱柱短期（一周日内）不用，对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中，从色谱仪卸开后要马上将柱两端密封。如果色谱柱长期不用，仅用上述方法来处理就不行了， 首先应用适合于柱填料的溶剂充分冲洗柱子，然后使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，此时，一定要将色谱柱的两端密封以防

47、止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象，因这可导致柱效的严重降低 。通常色谱柱可以在室温下保存，但对用于分离生物大分子的色谱柱（如分析糖的柱），除了必须用水充分洗清缓冲液外，最好保存在4 的低温下，以免细菌与其他微生物滋长；如果普通色谱柱放置于0以下的环境里，柱内就会结冰，这也将导致柱效的降低。6 色谱柱的故障排除6.1 液相色谱柱常见问题的解决6.1.1 造成色谱峰(不对称)拖尾的原因：（1）色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷；（2）柱头有污染；（3）样品超载；（4）样品溶剂不合适；（5）柱外效应；（6）化学或二次保留(硅羟基)效应；（7）缓冲容量不足或不合适；（8）重金属污染。6.1.2

48、 如何解决峰形拖尾的问题6.1.2.1 与化学有关的拖尾问题，解决方法如下：（1）流动相中，加入30mM的三乙胺(用与碱性化合物)或醋酸胺(用与酸性化合物)，未知化合物加醋酸三乙胺；（2）如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺)；（3）降低进样量至lug。6.1.2.2 与色谱柱有关的拖尾问题，解决方法如下：（1）如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96的二氯甲烷与4甲醇，加1氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。（2）使用保护柱。6.1.2.3 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽，解决方法如下：（1）进样体积过大，(通常<25uL)；（2）进样阀与色

49、谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应<20cm，内径为0007”)；（3）检测器流通池的体积过大。6.1.3 解决峰前延问题，解决方法如下：（1）柱温低，升高柱温；（2）样品溶剂选择不恰当，使用流动相作为样品溶剂；（3）样品过载，降低样品含量；（4）色谱柱损坏，更换色谱柱。6.1.4 解决额外的峰问题，解决方法如下：（1）样品中含有其他组分;（2）前一次进样的洗脱峰，增加运行时间或梯度斜率，提高流速；（3）空位或鬼峰，检查流动相是否纯净，使用流动相作为样品溶剂，减少进样体积。6.1.5 解决宽峰问题6.1.5.1柱外效应影响如下：（1）柱子过载；（2）检测器对反应时间或池体积响应

50、过大；（3）柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大；（4）记录仪响应时间太长；（5）小体积进样（例如：10ul 而不是100ul），以1：10 或1：100 的比例稀释样品，减小响应时间或使用更小的流通池，使用内径为0.007-0.01 的短管路，减少响应时间。6.1.5.2 保护柱污染或失效，更换保护柱；6.1.5.3 色谱柱污染或失效，塔板数较低，更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子；6.2.5.4 柱入口塌陷，打开柱入口，填补塌陷或更换柱子；6.1.5.5 呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰，选择其他类型的色谱柱以改善分离效果；6.1.5.6 柱

51、温过低，调高柱温，除非特殊情况，温度不易超过75；6.1.6 色谱峰的双峰问题长期使用后的色谱柱，如果有杂质进入，就会使色谱柱人口处的固定相“板结”并在流动相所产生的高压作用下，形成柱头的塌陷，被分析的样品组分的正常色谱峰就变成了双峰，这时可按下述方法来修复色谱柱 首先将柱头的紧固螺母旋下，这时就会发现柱头内的固定相已被压缩进去了严重时可缩进1Ohm1以上。在这种情况下，我们可用针尖将流动相表层板结变黄的部分抠掉，并以相同的固定相将此塌陷区填平、压实，再将色谱柱的紧固螺丝上紧，修复工作即告结束 用经过修复后的色谱柱再做样品时，色谱峰就恢复正常了。6.1.7 柱压高针对解决此故障的方法如下：（1

52、） 缓冲液盐分如(乙酸铵等) 沉积于柱内，先用4050的纯水,低速正向冲洗柱子, 待柱压逐渐下降后, 相应提高流速冲洗, 柱压大幅度下降后, 用常温纯水冲洗, 之后用纯甲醇冲洗柱子30 分钟;（2） 样品污染沉积，由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子, 然后换成甲醇冲洗, 接着用甲醇+ 异丙醇(4 + 6) 冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定) ,再用换成甲醇冲洗, 然后用纯水冲洗, 最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30 分钟以上。6.1.8 泵压力过高、过低的原因6.1.8.1 压力过高时应该注意如下内容：(1)流速设定过高，调整流速设定；(2)柱前筛板堵塞，在允许的情况下反冲色谱柱，更换筛板，更换色谱柱；(3)流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀，使用适当的流动相，冲洗色谱柱；(4)色谱柱选择不当，选择适当的色谱柱；(5)进样阀损坏，清洗或更换进样阀；(