大豆皂苷的分离纯化

1、题目： 葡聚糖凝胶色谱葡聚糖凝胶色谱结合结合制备型高效液相色谱制备型高效液相色谱分离纯化大豆皂苷分离纯化大豆皂苷 大豆皂苷大豆皂苷 皂苷皂苷又名皂甙或皂素，是固醇类或三萜类化合物的又名皂甙或皂素，是固醇类或三萜类化合物的低聚配糖体低聚配糖体总总称，因其水溶液能形成持久泡沫，象肥皂一样而得名，它广泛存在于称，因其水溶液能形成持久泡沫，象肥皂一样而得名，它广泛存在于植物和海洋动物体内植物和海洋动物体内。大豆皂苷大豆皂苷是一种常见的皂苷，它主要存在于是一种常见的皂苷，它主要存在于豆科植物豆科植物中。豆类植中。豆类植物种子中大豆皂苷的含量一般在物种子中大豆皂苷的含量一般在0.62%-6.16%之间。之

2、间。大豆皂苷是皂苷研究中起步较晚的一类大豆皂苷是皂苷研究中起步较晚的一类, 大豆皂苷具有明显的大豆皂苷具有明显的溶血溶血作用作用, 对人体健康不利对人体健康不利, 被视为被视为抗营养因子抗营养因子, 同时它具有苦味同时它具有苦味, 导致大豆导致大豆制品具有苦涩味制品具有苦涩味, 因此在豆类食品加工中总被设法除去。近年来，国内因此在豆类食品加工中总被设法除去。近年来，国内外大量研究表明：大豆皂苷外大量研究表明：大豆皂苷不仅毒副作用很小不仅毒副作用很小，而且其本上还具有许，而且其本上还具有许多多对人体健康有益对人体健康有益的生理功能。的生理功能。大豆皂苷的化学组成大豆皂苷的化学组成 大豆皂苷大豆皂

3、苷( Soyasapon ins)属于属于三萜类齐墩果酸型三萜类齐墩果酸型皂苷皂苷, 是三萜类同是三萜类同系物的系物的羟基羟基和糖分子环状和糖分子环状半缩醛羟基半缩醛羟基失水缩合而成失水缩合而成, 它可以水解生成多它可以水解生成多种种糖类糖类和和配糖体配糖体, 目前已确认的大豆皂苷约目前已确认的大豆皂苷约18种种, 是由是由5种皂苷元种皂苷元( Soyasapogeno 、)和糖基中的和糖基中的D 一葡萄糖醛酸一葡萄糖醛酸(glcUA)、D一葡萄糖一葡萄糖(glc)、D一半乳糖一半乳糖(ga1)、 D一木糖一木糖(xy1)、一一L一阿拉伯糖一阿拉伯糖(am) 、一一L一鼠李糖一鼠李糖(rha)

4、，6种单糖以及乙酰基大种单糖以及乙酰基大豆皂苷豆皂苷(A cety1- soyasaponin ) 所组成。所组成。 大豆皂苷依据其皂苷元的结构可分为大豆皂苷依据其皂苷元的结构可分为A族、族、B族、族、E族、族、DDMP族族大豆皂苷。大豆皂苷。大豆皂苷的理化性质大豆皂苷的理化性质 物理性质物理性质 纯大豆皂苷为白色粉末, 具有辛辣味和微苦味, 对人体各部位的粘膜具有强烈的刺激性。大豆皂苷是两亲性化合物, 具有亲水和亲油两种性质。大豆皂苷还可溶于水, 易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇中, 而且在含水丁醇或戊醇中的溶解度较好, 但它不溶或难溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。大豆皂苷具有热稳定性, 熔

5、点很高, 一般在熔融前就分解, 无明显的熔点。 化学性质化学性质 大豆皂苷显大豆皂苷显酸性酸性, , 加入甲酸能改善分离度。大豆皂苷溶液加入硫酸加入甲酸能改善分离度。大豆皂苷溶液加入硫酸铵、醋酸铅等中性盐类可产生沉淀。铵、醋酸铅等中性盐类可产生沉淀。大豆皂苷与苯肼反应生成红棕色沉淀, 与五氯化锑反应显紫蓝色, 在冰醋酸- 乙酰氯溶液中呈红色, 于氯仿- 硫酸中呈现绿色荧光 。故可应用这些性质, 来检测食物中的大豆皂苷的含量。应用前景应用前景 大豆皂苷是一种具有潜在应用价值的天然生理活性物质, 具有抗癌抗癌、调节免疫功能调节免疫功能、防治心血管疾病防治心血管疾病、抗菌抗菌、抗抗病毒病毒、护肝护肝

6、等多重生理功效。除用作药物外, 皂苷还可以作为高级化妆品高级化妆品和食品添加剂食品添加剂,如作为杀菌剂、抗氧化剂、发泡剂等在化妆品和食品工业中具有广泛的应用, 以及作为表表面活性剂面活性剂应用于化学化工行业。 我国是大豆生产大国, 资源非常丰富。每年用于加工豆制品和榨油所消耗的大豆数量非常巨大, 但目前对大豆的利用仅限于提取油脂和蛋白质仅限于提取油脂和蛋白质, 存在于叶子和副产品中的大豆皂苷常常被大量丢弃, 十分可惜。若能充分利用大豆废料大豆废料中像皂苷这样的特殊成分, 必将获得较大的经济和社会效益经济和社会效益。大豆皂苷的分离纯化大豆皂苷的分离纯化 大豆中除了含有大量的脂质和糖质, 还含有固

7、醇配糖体、异黄酮糖体, 其中大豆皂苷的含量只有0.6 %,而且大豆皂苷是强极性酸性皂苷强极性酸性皂苷, 有复杂的化学成分, 所以大豆皂苷的分离提取比较困难。 大豆皂苷和异黄酮在大豆中共存，在用乙醇浸提和大孔吸附树脂提取大豆皂苷时， 往往会与大豆异黄酮大豆异黄酮一并被提取出来，它们分子极性有重叠，结构类似分子极性有重叠，结构类似，皆是由苷元与配糖体组成的糖苷类组分， 这对大豆皂苷单体的制备造成了很大的干扰，因此需要除去大豆异黄酮，利用高纯度总大豆皂苷来制备单体。 葡聚糖凝胶色谱法葡聚糖凝胶色谱法分离大豆皂苷和大豆异黄酮分离大豆皂苷和大豆异黄酮 大豆皂苷与大豆异黄酮存在结构与分子质量的差异，大豆皂

8、苷为三萜类糖苷，大豆异黄酮中有一定量的异黄酮糖苷， 大豆皂苷分子质量在7661 436，大豆异黄酮分子质量在254532。 两种总体化合物分子立体结构之间存在较大的差异，因此可以采用葡聚糖凝胶色谱分离技术对两种总体化合物进行初步的分离。 大豆皂苷的分离纯化大豆皂苷的分离纯化 葡聚糖凝胶色谱也称为分子排阻色谱， 凝胶柱系由均匀装填的多孔凝胶微粒组成， 小分子可以进入孔隙之中，大分子不能进入孔内，只能随流动相在凝胶颗粒间隙中流动，最先被淋洗出来，因此作为分子筛使用，分离大小不同的分子。 这一技术为蛋白质等生物大分子提供了非常温和的分离方法。本试验中采用甲醇为洗脱溶剂，利用葡聚糖凝胶色谱法分离得到高

9、纯度的总大豆皂苷，为后续大豆皂苷单体制备提供很好的原料。分离纯化方法分离纯化方法 制备型高效液相色谱技术制备型高效液相色谱技术以获得大量的单成分为目的，具有分离条件比较温和，分离检测过程中一般没有样品被破坏，装置简单有效等优点，在天然药物的研究中发挥了重要作用。被称为对维生素补充剂的“定案”。文章作者，来自美国约翰霍普金斯医学院以及英国华威大学，还有一位是该杂志的高级副主编，“均为医学界翘楚”。1 葡聚糖凝胶色谱法分离大豆皂苷和异黄酮葡聚糖凝胶色谱法分离大豆皂苷和异黄酮 利用葡聚糖凝胶色谱法分离大豆皂苷和大豆异黄酮，湿法填装葡聚糖凝胶色谱柱（49mm310mm）。称取400mg 大豆皂苷粗提物

10、，溶解于1mL 甲醇。进样体积150 L，采用甲醇为洗脱剂，设定洗脱流速3mL/min，选定监测波长为215nm，根据制备图谱接收了5 个组分峰。旋转蒸发，回收甲醇，冷冻干燥得粉末样品。 分离纯化方法分离纯化方法 图1 为采用1.2.2 节方法分离大豆皂苷和大豆异黄酮215nm 处紫外吸收谱图。由葡聚糖凝胶色谱法的原理、各类皂苷和异黄酮的紫外吸收特征以及分子结构和分子质量的差异， 结合HPLC 图1 为分离大豆皂苷和大豆异黄酮215nm 处紫外吸收谱图。由葡聚糖凝胶色谱法的原理、各类皂苷和异黄酮的紫外吸收特征以及分子结构和分子质量的差异， 结合HPLC分析， 初步推断峰1 为A 类大豆皂苷，

11、峰2 为DDMP 类及B 类大豆皂苷，峰3、峰4 和峰5 为异黄酮峰。2 高效液相色谱法制备大豆皂苷单体高效液相色谱法制备大豆皂苷单体 制备型高效液相色谱技术制备型高效液相色谱技术以获得大量的单成分为目的，具有分离条件比较温和，分离检测过程中一般没有样品被破坏，装置简单有效等优点，在天然药物的研究中发挥了重要作用。 利用制备型高效液相色谱仪，通过优化流动相、梯度洗脱程序、进样量，以总大豆皂苷为原料，进行大豆皂苷单体制备。根据谱图手动收集各个峰组分，旋转蒸发，回收乙腈，冷冻干燥得粉末状样品，进行HPLC 纯度检测及UPLC-MS 分析。被称为对维生素补充剂的“定案”。文章作者，来自美国约翰霍普金

12、斯医学院以及英国华威大学，还有一位是该杂志的高级副主编，“均为医学界翘楚”。利用高效液相色谱法对各个峰组分进行分析利用高效液相色谱法对各个峰组分进行分析 检测条件如下： 分离柱：Aquasil C18 （150mm4.6mm，3m）；温度：30 ；样品浓度：5mg 皂苷样品溶于1mL 甲醇；进样体积：20L；流动相流速：1mL/min；流动相：A：0.002%（体积分数）乙酸-水溶液，B：0.002%（体积分数）乙酸-乙腈溶液；检测器：二极管阵列检测器（200800nm，205nm 为监控波长），蒸发光散射检测器； HPLC 梯度洗脱程序为： 010min，10% B；1030min，1030

13、% B； 3080min，3040% B；80 90min，40100% B； 90 110min，100%B；110120min，10010%B。 各种分离纯化方法的比较各种分离纯化方法的比较 对身体而言，永不相负的万灵药并不是补剂，而是均衡膳食与规律运动。对身体而言，永不相负的万灵药并不是补剂，而是均衡膳食与规律运动。 HPLC 分析按照图1 接收的5 个峰组分，并与大豆皂苷粗提物的HPLC 分析谱图进行对比， 结果如图2 所示。由HPLC 保留时间可以确定峰1 和峰2 是皂苷；峰3、峰4 和峰5 是异黄酮，不含任何种类的皂苷，由此看出，凝胶色谱可以很好地将大豆异黄酮和大豆皂苷分离， 能得

14、到较高纯度的大豆皂苷粗分产物， 这将有利于大豆皂苷单体的制备。3 大豆皂苷单体纯度分析和结构鉴定大豆皂苷单体纯度分析和结构鉴定 采用最优HPLC 制备条件进行大豆皂苷单体的分离纯化，得到如图3 所示的谱图： 对身体而言，永不相负的万灵药并不是补剂，而是均衡膳食与规律运动。对身体而言，永不相负的万灵药并不是补剂，而是均衡膳食与规律运动。 3 大豆皂苷单体纯度分析大豆皂苷单体纯度分析 HPLC 分析大豆皂苷单体纯度分析大豆皂苷单体纯度 从第33min 开始，按照保留时间手动接收峰组分，至76min 共接收到17 个峰组分。参考保留时间以及紫外最大吸收波长推出，33min 之前为大豆异黄酮特征峰，

15、通过比较异黄酮和皂苷的峰面积， 再次说明利用葡聚糖凝胶色谱能分离出绝大部分异黄酮， 这样对皂苷单体制备的干扰就减少了很多。同时，峰14、15、16 和17在295nm 有最大紫外吸收，从而可以推断此4 个峰组分为DDMP 类皂苷。此外，制备谱图所示，经优化后所采用的制备条件，各个峰分离度较好，达到了基线分离的效果。 对身体而言，永不相负的万灵药并不是补剂，而是均衡膳食与规律运动。对身体而言，永不相负的万灵药并不是补剂，而是均衡膳食与规律运动。 HPLC 检测皂苷单体纯度检测皂苷单体纯度 HPLC 分析结果表明，制备得到9 种纯度90%以上的大豆皂苷，其中99%以上的大豆皂苷单体4 种。有些成分

16、因含量极少， 由于滞后性或者后续处理， 其纯度不高。尽管所有的提取及处理温度都在40 以下，但是因DDMP 类皂苷的稳定性差， 仍然有部分DDMP 类皂苷降解为B 类皂苷。4 UPLC-MS 鉴定大豆皂苷单体鉴定大豆皂苷单体 利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用检测确定高效液相色谱制备得到的各个峰组分。 UPLC 条件：条件： 分离柱Acquity C18 BEH（250mm10.0mm，0.17um）； 流动相为A：0.1%（体积分数）甲酸-水，B：0.1%（体积分数）甲酸-乙腈，流速0.3mL/min； 梯度洗脱程序 03min，1040%B；38min，4070%B； 812min

17、，70100% B；1220min，100%B； 2020.5min，10010%B；20.522min，100%B。 质谱条件：质谱条件： 毛细管电压3.2 kV， 取样锥电压35V，二级锥孔电压5V，离子源温度110，脱溶温度350 ，脱溶剂气流量600.0 L/Hr，质核比扫描范围1001 500。对身体而言，永不相负的万灵药并不是补剂，而是均衡膳食与规律运动。对身体而言，永不相负的万灵药并不是补剂，而是均衡膳食与规律运动。 根据制备出的单体的质量，选择了1、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、17 号峰进行了UPLC-MS 结构鉴定。由于在制备时通过紫外吸收特征得出峰2

18、 和峰7 为异黄酮峰；峰3 和峰5 出现的稳定性差；而峰16 最终收集得到的质量很少，故而以上各峰未进行检测。 根据制备出的单体的质量，选择了1、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、17 号峰进行了UPLC-MS 结构鉴定。由于在制备时通过紫外吸收特征得出峰2 和峰7 为异黄酮峰；峰3 和峰5 出现的稳定性差；而峰16 最终收集得到的质量很少，故而以上各峰未进行检测。 如图4 所示， 其中395.6649 是大豆皂苷ac3-Ab（1394）分子结合一个氢原子形成的，975.5149是ac3-Ab 分子失去C-22 位末端的Ara （133）和Glc（162）及其上的3 个乙酰基，再结合一个氢原子形成的， 可以推断1 号峰为大豆皂苷ac3-Ab。同理分析其余各峰的质谱图，确定峰4、峰6、峰8及峰13 分别为大豆皂苷Aa、Ab、Ae、Be。9 号峰和10 号峰、11 和12 号峰质谱图基本相同，分析后判断分别为大豆皂苷Af 和大豆皂苷Bb。参考文献参考文献 1 KITAGAWA I. Revised structures of soyasapogenols A, B and E,oleanene- sap