丝氨酸蛋白酶抑制剂

1、LOGO丝丝 氨氨 酸酸 蛋蛋 白白 酶酶 抑抑 制制 剂剂丝氨酸蛋白酶抑制剂 一、物质简介二、研究进展 1. 理化性质、种类、分布及结构 1.1 理化性质 1.2 种类、分布 1.3 分子结构 1.4 基因表达及cDNA编码特点（若有研究需综述） 2 作用机理 3 功能作用 4 应用 4.1 应用 4.2 作为食品、化工、临床药物的优点与局限 4.3 研究展望，重点是需要研究的方面 三、活性物质的研究方法及手段 3.1研究的技术路线及方案 3.2分离纯化方案 3.3 活性鉴定方法 3.4 基因克隆物质简介 丝氨酸蛋白酶抑制剂具有广泛的生物活性和作用，在新药研制和防治疾病方面具有广阔的前景。蛋

2、白酶抑制剂可与病毒蛋白酶催化基因结合抑制酶活性，导致蛋白前体裂解和形成成熟病毒体。作为一类重要的艾滋病药物，蛋白酶抑制剂市场可谓是一块诱人的大蛋糕。目前已经投入市场的蛋白酶抑制剂主要有：奈非那韦、沙奎邦韦、茚地那韦、安泼那韦、利托那韦、洛匹那韦及复合制剂。综述 1 理化性质种类分布及结构 目前在人、动物、植物、真菌、细菌及病毒中发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂超过1500种，根据其序列相似性、二硫键拓扑结构和反应位点的不同，Laskowski和Kato (1980)将丝氨酸蛋白酶抑制剂分为八个不同的超家族，2000年进一步分为17个蛋白家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂一般为单一肽链蛋白质，且氨基酸残基具有较强

3、的保守性。丝氨酸蛋白酶抑制剂分子一般由350500个氨基酸残基组成，在X光下的晶体结构一般为球状蛋白并含有9个螺旋和3个折叠。1.1 理化性质综述分布分布：广泛存在于动物、植物、微生物体中。在动物体中。种类：种类：根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用。 1.2 种类、分布综述 丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类单链蛋白质，它们的一级结构及特性多种多样，仅氨基酸的数量就从大约29个到400个。经序列分析和X射线衍射图谱分析，这些抑制剂并非

4、同源。基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为至少20个家族。1.3 分子结构综述 丝氨酸蛋白酶抑制剂按其抑制机理的不同分为典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂、非典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂及serpin类丝氨酸蛋白酶抑制。 典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂 非典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂多来源于吸血生非典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂多来源于吸血生物，特异性地阻断参与凝血反应的酶，尤其是物，特异性地阻断参与凝血反应的酶，尤其是凝血酶和凝血酶和XaXa因子。这类抑制剂通过因子。这类抑制剂通过N N端与酶的酶端与酶的酶切位点相互作用行使抑制功能。切位点相互作用行使抑制功能。 2 作用机

5、理综述 最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体内的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞内蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响3 功能作用综述 天然的蛋白酶抑制剂具备抗病毒的潜能，能控制外源细菌释放的蛋白酶水解抑制特异性病毒生长并使自身细胞不受伤害。基于上述功能，蛋白酶抑制剂作为药物使用已经被研究开发了好多年，目前已被用于治疗人类免疫缺陷病（HIV）和高血压等疾病。血管紧张素转化酶（ACE）抑制

6、剂是一个用于药物治疗的蛋白酶抑制剂。ACE能催化血管紧缩素和血管紧缩素的水解，一个有效的血管收缩药能使缓激肽失活。而ACE抑制剂通过降低周围血管阻力达到降低血压的目的，同时ACE抑制剂能降低蛋白尿和稳定肾功能，对治疗糖尿病肾病有疗效。ACE抑制剂的使用最初源于1977年。目前其它的ACE抑制剂也已投入市场。4.1 应用综述 HIV蛋白酶在PhePro，PheLeu，PheThr的特异性剪切，使得抑制剂的设计必须具备高度可变性。目前，有8类蛋白酶抑制剂用于HIV治疗，包括替拉那韦，印地那韦，沙奎那韦，洛匹那韦。新一代的抑制剂正在被开发以发挥最大的疗效，来治疗病患。目前治疗HIV的第二代蛋白酶抑制

7、剂TMC114已进入临床阶段测试中。 这些药物制剂的研究成功引起了人们对于蛋白酶抑制剂治疗作用的极大兴趣。下面将集中介绍蛋白酶抑制剂针对多种疾病的潜在使用价值。综述 丝氨酸蛋白酶抑制剂具有广泛的生物活性和作用，在新药研制和防治疾病方面具有广阔的前景。蛋白酶抑制剂可与病毒蛋白酶催化基因结合抑制酶活性，导致蛋白前体裂解和形成成熟病毒体。现阶段，经国家食品药品监督管理局批准生产的蛋白酶抑制剂仅有3个品种。这主要是由于蛋白酶抑制剂在合成工艺方面存在相当的难度，受限于技术、成本等问题，目前主要利用物理、化学或者生物化学方法，从动植物及微生物体内收集材料例如动物的血液以及植物的块根块茎等提取各类丝氨酸蛋白

8、酶抑制剂，并不能大量低成本地获得抑制剂蛋白，从而使得其不能大规模投入生产4.2 作为食品、化工、临床药物的优点与局限综述 蛋白酶抑制剂在合成工艺方面存在相当的难度，受限于技术、成本等问题，目前主要利用物理、化学或者生物化学方法 因此，研究人员已着手构建含有抑制剂基因的工程菌株，利用微生物发酵成本低、产量大和可控性高的有点，尝试进行规模化生产，满足人们对于抑制剂的实际需要。4.3 研究展望，重点是需要研究的方面3 3 活活性物性物质的质的研究研究方法方法及手及手段段3.1 研究的技术路线及方案综述1、收集动物组织，以发色底物对其进行丝氨酸蛋白酶抑制活性测定，包括胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白

9、酶和胰凝乳蛋白酶。3.2分离纯化方案综述2、通过ConA Sepharose 4B亲和层析、Sephadex G-75凝胶过滤、反相高压液相等生化技术手段，从中获得一个表观分子量约为43kDa的单链蛋白。我们将其命名为CaSPI。CaSPI对胰蛋白酶具有专一性的抑制活性。Edman降解法测序结果显示CaSPI的N-末端氨基酸序列为EAHPSHSGED。糖蛋白检测结果表明CaSPI属于糖蛋白。接合活性测定中，CaSPI在SDS-PAGE电泳时能与胰蛋白酶形成稳定的复合物，该结果提示它可能属于serpins蛋白超家族中的一员。综述3、利用RT-PCR和RACE技术，获得了一条全长为1397bp，其

10、中包括1233bp完整的开放阅读框的核酸序列，编码410个氨基酸。对由核酸序列推测的氨基酸序列分析显示，在52-408处具有SERPIN结构域。经过BLAST比对，该蛋白与来源于动物脑膜液的CP9等serpins超家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有高度同源性，并且在P1位置处为精氨酸（Arg），推测该蛋白属于Sepins超家族一员综述4、对所获得的蛋白酶抑制剂CaSPI进行结合比和及最小抑制常数Ki测定，结果为CaSPI与胰蛋白酶结合比为1.15：1时能完全抑制蛋白酶水解活性，Ki为0.46M，表明CaSPI为竞争性抑制剂。并对其进行稳定性（时间、温度、pH、金属离子及变性剂）检测，表明CaSPI具

11、有相当的稳定性。综述热稳定性 材料中丝氨酸蛋白酶抑制剂样品溶液（质量终浓度50mg/ml）在30、40、50、60、70、80、90和100加热10 min, 取出后立即放冰上冷却，然后用检测抑制剂活性的方法测定处理样品的抑制活性酸碱稳定性 将材料中丝氨酸蛋白酶抑制剂样品溶液（质量终浓度50 mg/ml）与等体积的pH 2-11的各种缓冲溶液（缓冲溶液为0.2M氨基乙酸-HCl 缓冲溶液， pH 2和3；0.2M乙酸-乙酸钠缓冲溶液，pH 4和5；0.2M磷酸氢盐缓冲溶液，pH 6,7和8；0.2M氨基乙酸-NaOH缓冲溶液，pH 9,10和11）混合，4放置18h，然后用0.4M TrisHCl缓冲溶液，pH 7.8调整抑制剂混合溶液的pH值为7.8，并测定其抑制剂活性。3.3 活性鉴定方法综述 利用RT-PCR和RACE技术，获得了一条全长为1397bp，其中包括1233bp完整的开放阅读框的核酸序列，编码410个氨基酸。对