大鼠线栓(MCAO)模型+灌注取脑+TTC染色

1、第一部分线栓模型制作1实验器材（从左到右）：第一行：干棉球、酒精棉球、10%水合氯醛+注射器、碘伏+棉签第二行：三种不同粗细的鱼线（鱼线最好在2.0、2.5mm处各用记号笔作好标记，便于观察进入距离）、弯盘内为手术器材第三行：记号笔、自制拉钩（皮筋+曲别针+大头针）2、麻醉:可用饮料瓶自制捕鼠器（适用于不敢手抓大鼠的），用于打麻药，根据大鼠的重量选择不同粗细的饮料瓶（太粗了大鼠 可在瓶中回头）效果图3、麻倒后绑在手术台上4、剪去颈前的鼠毛，碘伏消毒。5、沿经部正中切开皮肤。说明：切开皮肤前最好将结扎动脉的线事先剪好（后面会用到）6、钝性分离皮下组织。如图：大鼠腹侧可见事先剪好的结扎线。7、分离

2、到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩。8、分离动脉鞘。如图：分离好后见光滑的颈总动脉。9、分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，注意中间那根线不要系紧，用来插鱼线时防止出血的10、夹闭颈内动脉，用眼科剪将颈总动脉剪一小口11、插入鱼线，鱼线进入颈内动脉后按图中注释方法插（成功率在90%以上）说明：250g（1）这一步鱼线选择是关键，根据大鼠重量（作的多了后根据动脉粗细就可选择了）选鱼线。我们的经验是:下的选0.26mm的线，250-300g 的选0.26mm蘸腊的或 0.28的都可以。（2）如果遇到鱼线怎么也查不进去的情况，可让大鼠休息一会，换细点的鱼线再

3、试，这种情况不一定都是进到翼腭动脉了，我曾解剖过 4例这种情况的大鼠，有三例都是在如颅的地方卡住了，可惜我们手里没有0.24mm的鱼线15分钟,（3） 通过实践，我们认为结扎或夹闭翼腭动脉没有必要，按我们的方法，熟练的话，从切开到缝合完毕也就是算上准备工作（如麻醉、消毒等）半小时也可以搞定了，这样一上午两人作10只大鼠不成问题。0.26mm（4）我们体会最好用蘸腊的鱼线作模型，好处是进线深度控制的好，不容易出现蛛网膜下腔出血。我们曾试过的鱼线（不带腊）在 250g以下的大鼠进入深度足有 2.5cm12、成功后结扎中间那根线，可见第一个标记距动脉分叉约2mm13、缝合。14、缝好后用酒精棉球消毒

4、皮肤缝合处。15、缝好后的效果如图，外面的鱼线最后用记号笔涂黑，便于再灌拔线时观察。16、将大鼠放回笼内17、2小时再灌18、醒后看效果，左爪不能伸展（完全醒后可见绕圈或追尾、倾倒），我们的体会，症状2-3分的死亡率高，1-2 分的死亡率低，有的大鼠第二天或几天后可无明显症状，但取脑后还是有梗死灶的。附：一般文献上的 MCAO制作方法+评分标准局灶性脑缺血再灌注模型的制备根据Ionga提出的可逆性大脑中动脉闭塞（MCAo线栓法并根据大鼠脑解剖结构图加以改进制作局灶性脑缺血再灌注模型，以10%水合氯醛 0.3ml/kg腹腔麻醉，颈正中切口，暴露颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）及翼腭动脉，将

5、0.26mm单丝尼龙鱼线头端 0.5cm用石蜡包被，并于20mm长处标记，全部大鼠均通过右侧CCA切口处插入，翼腭动脉短暂夹闭以防误插，栓线长度自CCA分叉处约1820mm根据动物体重而定，栓塞右侧大脑中动脉，然后缝合皮肤，栓线尾端部分固定于皮肤上。缺血达到2h后小心抽出栓线,即形成再灌注。假手术对照只是不插入尼龙鱼线，其余步骤同手术组。在缺血期间及再灌注后2h保持体温在（37 ±0.5） C。模型成功的标志为以大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪,站立不稳,提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。神经功能缺失体征评分参考Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评

6、分。0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4 分:不能自发行走,意识丧失。分值越高，说明动物行为障碍越严重。第二部分灌注取脑流程：1）麻醉2）开胸3）心脏左心室穿针，剪开右心耳4）生理盐水冲水5）4%多基甲醛固定6）取脑7）保存或切片.1多聚甲醛的配置：一般方法为：4%多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取 40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至 6065C,使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0 ,使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下

7、pH,过滤后定容至 1000ml，室温或 4C保存备用。我们用的方法：加热至6065C固然融解的快，不过容易挥发， 气味难闻，不是好的选者。 我们是这样做的，感觉不错，在此强烈推荐：先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37c水浴或温箱密封放置 2天，就能全溶。2灌注所用器皿：一般用输液瓶及输液管，为了提高灌注速度可以用较大号的针头及增加灌注压力3麻醉后开胸：暴露充分些容易心脏穿刺及剪开右心耳。箭头所指为右心耳4心尖插入灌注针头，剪开右心耳，开放静脉血。5夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可6先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可

8、改灌注多聚甲醛。7灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注 的脑组织白而硬。8取脑过程:剪开皮肤暴露头及颈段，从颈椎处剪断颈髓。9分离除去后颈部肌肉10用弯钳仔细剔除颅骨11分离颅骨时注意硬脑膜，避免硬脑膜划伤脑组织。12取脑时可以从延髓开始，慢慢分离颅底组织，这样不容易损伤大脑。13未灌注的脑f灌注的脑14后15取脑后在多聚甲醛中4c固定4-6小时，取材，脱水，包埋后可长期保存。16石蜡包埋后的样本第三部分TTC染色19581原理：TTC（2, 3, 5氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物，1894年首次合成用来检测种子的生存能力,年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶一核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢 酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。2取脑：可麻醉后直接取脑或经生理盐水灌注后取脑。因为脑组织未用多聚甲醛固定，所以较软，取脑时更应仔细，保持大脑的完整性。3 20度冰箱中速冻 20分钟左右，便于切片4切片：一般切成 56片，每隔2mm切一片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在 漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。（参考：张