piRNA的生物合成及其在生殖细胞中的功能

1、piRNA的生物合成及其在生殖细胞中的功能Carla Klattenhoff and William Theurkauf* 小干扰RNA和微小RNA是由双链的RNA前体经核酸内切酶Dicer切割生成的，并与Argonaute家族蛋白共同作用破坏转录物或沉默翻译。一类清楚的RNA核苷酸长度为24-30个，通过Dicer依赖型机制生产，与Argonaute蛋白家族中的Piwi蛋白结合。关于苍蝇、鱼和小鼠的研究暗示了Piwi蛋白结合RNAs（piRNA）在生殖细胞发育、沉默自私DNA元件和维持种系DNA完整性中的功能。然而，无论是piRNA染色质主要控制机制、基因转录、RNA稳定性或RNA翻译，还是

2、piRNA的生物合成都不是很清楚。在这里，我们回顾了近期的关于piRNA生成和功能的研究，并讨论关于这个耐人寻味的新型小RNA的悬而未决的问题。前言1993年，安布罗斯和他的同事发现，线虫的lin-4基因通过负调控编码一个小调控RNA并与lin-14的转录单元互补（Lee等人，1993）。这些开创性的研究确定了第一个微小RNA（miRNA）。在动物和植物实验室中，非编码的小RNA随后成为强大的实验工具和关键的发育调节者（Baulcombe，2004；汉农，2002；Kloosterman和Plasterk，2006；梅洛和康特，2004）。目前，21个核苷酸（nt）的小干扰RNAs（siRNA

3、s）被频繁用于实验性的操纵基因表达，它是通过Dicer核酸内切酶处理长双链RNA（dsRNA）的前体得到的，随后形成中间体RNA-蛋白质复合体。该中间体取代RNA的其中一条链（被称为“过客链”），并产生成熟的RNA诱导的沉默复合体（RISC），其中包含一条能够与Argonaute蛋白家族结合的单链（“引导链”）。当siRNA的引导链与靶RNA完全互补时，Argonaute蛋白识别特异性序列并切割（Hannon，2002；Meister和Tuschl，2004）。在体内，siRNA途径会降低病毒生命周期中RNA中间体的产生，因此在限制病毒感染中起重要作用（Wang等，2006）。通过比较，miR

4、NA是从由染色体基因编码的茎环转录物中衍生出来的。初级茎环RNA（priRNA）是在细胞核中由Drosha核糖核酸酶催化产生premiRNAs，然后从细胞核中出来并在细胞质中被Dicer酶内切酶催化裂解，从而生成22 nt的成熟miRNA。这些miRNA与Argonaute蛋白结合并诱导靶基因活性的同源依赖性下调。miRNA与其目标转录物间的不完全碱基配对将会诱导翻译沉默，而完美的碱基配对将触发RNA破坏。在miRNA途径突变的突变体中，发育破坏并且经常导致胚胎致死（Du和Zamore，2005；Kloosterman和Plasterk，2006）。最近的研究发现了一类新的24-30 nt的R

5、NA，其由无Dicer依赖性机制催化，并产生能够与Argonaute蛋白家族中的Piwi蛋白结合（Aravin等，2006；Brennecke等，2007；Girard等，2006；Grivna等，2006；Gunawardane等，2007；Houwing等，2007；Lau等，2006；Saito等，2006；Vagin等，2006；Watanabe等，2006）。其对于雌雄果蝇生育能力是必不可少的（Lin和Spradling，1997）。在一些系统中，这些与Piwi蛋白相互作用的RNA（piRNA）主要是从转座子和其他重复序列元件中衍生而来的（Brennecke等，2007；Gunawa

6、rdane等，2007年；Saito等，2006），从而导致它们曾定义为重复序列偶联的小干扰RNA（rasiRNAs）（Aravin等，2003）。现在已很清楚，piRNA即可以从重复序列也可以从复杂的DNA序列元素中衍生出来（Aravin等，2007；Brennecke等，2007；Houwing等，2007），并且piRNA包含rasiRNAs。因此，我们在下面的讨论中使用更通用的术语piRNA。小鼠、果蝇和斑马鱼的遗传学研究表明，piRNA在种系发展中是至关重要的（Carmell等，2007；Chen等，2007；Cook等，2004；Cox等，1998；考克斯人，2000；Deng和L

7、in，2002；Gillespie和Berg，1995；Houwing等，2007；Kuramochi-Miyagawa，等，2004；Pane等，2007；Schupbach和Wieschaus，1991）。然而，参与piRNA合成的蛋白质揭示，其能够在体细胞中调控基因表达（Grimaud等，2006；Pal-Bhadra等，2002；Pal-Bhadra等，2004），以及影响学习和记忆（Ashraf等，2006），这表明piRNA可能对生物进程造成较广泛的影响。piRNA的合成piRNA的长度24-30 nt表明，他们不由Dicer酶（切割双链前体产生21-22 nt的产物）产生的（Be

8、rnstein等，2001）。最近的基因研究一致表明，piRNA是通过一个切酶非依赖性过程产生的（Houwing等，2007；Vagin等，2006年）。在果蝇中，从其基因组的起源和与Argonaute蛋白的结合研究中，能够洞察piRNA的合成机制（Aravin等，2006；Brennecke等，2007；Girard等，2006；Grivna等，2006年；Gunawardane等，2007；Houwing等，2007；Lau等，2006；Saito等，2006；Vagin等，2006）。在果蝇卵巢中，绝大多数piRNA来自于一定数量的近着丝粒和端粒，这些位点富含反转录转座子序列（Brenn

9、ecke等，2007）。绝大多数piRNA是从反义链上的反转录转座子序列派生得到，并且这些RNA优先与Argonaute蛋白家族的Piwi蛋白和Aubergine蛋白（Aub）结合。相反，piRNA的正义链优先与Argonaute蛋白3（Ago3）结合（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）。Piwi蛋白、Aub蛋白和Ago3蛋白，与piRNA形成复合体，可以切割靶RNA引导链在第10和11个碱基之间的位点（Gunawardane等，2007；Saito等，2006）。在果蝇中，从相反链获得的piRNA显然具有一个10 nt的重叠。此外，反义piRNA与Piwi和

10、Aub结合表明，其更倾向与结合在5端有一个U残基的序列；而正义piRNA与Ago3结合是因为其序列往往在第10位有一个A残基（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）。基于这些观察，这两个团队同时提出了piRNA合成的“乒乓”模型，其中Ago3与正义链piRNA结合并催化反义链，其在A:U碱基对处进行切割并产生具有5端的反义piRNA（图1）（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）。这个具有5端的裂解产物拟与Aub或Piwi蛋白结合，在核酸水解处理3端后，产生成熟的23-30 nt的反义piRNA（图1B）。而后，成熟的反义piRNA-

11、Argonaute复合物结合并切割RNA的正义链，沉默基因表达和产生的5端的能与Ago3结合的正义piRNA前体（图1D）。3端的成熟正义piRNA继续反应，完成循环（图1E）。该模型是基于在果蝇中的研究，但最近的研究结果表明，一个类似机制可能在小鼠中存在（Aravin等，2007）。图1，piRNA合成的乒乓球模型。（A）Argonaute家族蛋白中的Piwi蛋白类的Argonaute蛋白3（Ago3）与正义链piRNA（蓝色）结合，并指导靶反义链转录物（红色）的裂解，产生5'端反义链piRNA。（B）Aubergine（Aub）和Piwi蛋白（未示出）与所得到的piRNA前体结合，

12、然后剪切形成piRNA的最终长度。这步骤可能是由假定的核酸酶Squash和Zucchini来催化。（C）果蝇的Hen1甲基化piRNA的3'端（3OME）。（D）Aub-反义链piRNA复合体催化正义转录物（蓝色）的裂解，产生5'端的正义piRNA。（E）Ago3与修剪的和（F）甲基化后的piRNA前体结合，即为反义链piRNA。根据Brennecke等人提出的模型（Brennecke等，2007）。在piRNA合成的“乒乓”模型中，调解一些拟议的步骤的蛋白质尚未确定，但最近的研究结果可能有助于填补其中的一些空白。例如，在果蝇中突变zucchini和squash的基因会扰乱pi

13、RNA的生产，并导致反转录转座子的损失沉默，而这两个基因都编码假定的核酸酶（Pane等，2007）。因此，zucchini和squash可切割3端以产生成熟piRNA（图1）。此外，成熟piRNA的3端被甲基化（Kirin和Mourelatos，2007；Ohara等，2007）。在果蝇中，该反应是由Hen1编码的RNA甲基转移酶（也称为DmHen1和Pimet）进行的，当piRNA与Argonautes蛋白结合后再甲基化（Horwich等，2007；Saito等，2007）。Hen1基因突变的果蝇突变体其piRNA的长度和稳态水平将减少，这表明甲基化限制3端加工和增加了piRNA的稳定性（H

14、orwich等，2007）。甲基化作用也可能影响了piRNA途径中piRNA与其余组分之间的相互作用。然而，果蝇hen1突变体是可行和可育，这表明该基因修饰对于piRNA功能不是必不可少的（Saito等，2007）。在果蝇中，遗传筛选已经确定了几个额外的对于piRNA合成或功能所必需的因素。例如，armitage和spindle E基因编码的假定解旋酶是piRNA合成和反转录转座子沉默所必需的（Aravin等，2004；Vagin等，2006）。在piRNA合成过程中，这些蛋白质可以展开双链中间体形态，识别靶基因，或者裂解。相反地，cutoff基因是反转录转座子沉默所必需的，但不是piRNA合

15、成必需的（Chen等，2007）。酵母的同源Cutoff曾揭示了RNA衰变（Kim等，2004；Xue等，2000）。因此，通过增强piRNA-Argonaute蛋白复合物的活性，Cutoff可能有助于基因沉默。piRNA路径的条块分割 近日，果蝇的Tudor结构域蛋白Krimper已经被证明与抑制逆转录转座子和piRNA基因的产生有关。这种蛋白质是类核周体的一个组成部分，即已经证实与RNA加工种系特异性核周结构和krimper蛋白突变阻断类核周体形成有关。有趣的是，许多与piRNA路径相关蛋白积聚在类核周体中，这是突变的滋卵细胞。果蝇卵母细胞是由带有15个与合成RNAs和蛋白有关的滋卵细胞通

16、过环状管道运输至卵母细胞而形成。类核周体最初在电子显微照片确定为围绕滋卵细胞核非晶电子致密的云。在解旋酶和核酸酶作用下，类核周体中富集了Argonautes蛋白家族中的Piwi亚家族 ：Aub和AGO3。与大多数piRNA基因路径相关的蛋白，果蝇的Piwi几乎完全被滋卵细胞同化。这些观察表明，piRNA的产物和功能可能会被割裂开来。 piRNA与Argonaute蛋白的复合物似乎在该途径中是具有催化活性的效应的，而这些定位研究表明的Piwi介导了核函数的piRNA的途径，Ago3和Aub驱动细胞质功能。根据对正义链与反义链Argonaute蛋白的复合物在类核周体的性质，我们推测出piRNA的生

17、源论机制。在这个模型中，piRNA的前导转录物正义链被输出到类核周体，在那里它们被Aub-反义piRNA基因复合物裂解，沉默靶基因的表达和产生的有义链的piRNA前体。这些与Ago3相关的有义链前体被修剪到成熟的长度。Ago3-有义链复合物催化裂解反义链转录物，产生了与Aub和Piwi相关的piRNA前体。成熟的Aub复合物依然留在类核周体中发挥裂解正义链转录产物，促使piRNA 合成的作用，而成熟的Piwi复合物则被运送至细胞核中介导异染色质组装和转录沉默，或共同转录RNA的破坏。虽然该模型是高度投机性，但也提出了一些明确的预测，因此可以作为对piRNA的生源论进一步研究一个有用的框架。在果

18、蝇的遗传研究中，小鼠和斑马鱼的研究已经提供了洞察了piRNA的生物学功能，并突出这些RNA在生殖细胞发展的重要意义。piRNA途径突变的表型在这些系统概括如下。3、 图解Fig.B:（1）-（2）正义链被转录并从细胞核中输出；（3）-（4）在类核周体中，Aub-piRNA复合物降解正义链转录物，产生与Ago3相关的piRNA复合物；（5）-（6）Ago3-piRNA复合物降解反义链转录物，产生与Aub和Piwi相关的piRNA复合物；（7）Aub-piRNA复合物仍然留在类核周体中继续降解正义链复合物；（8）Piwi-piRNA复合物进入细胞核中，介导位于常染色质和异染色质上的同源基因。雌果蝇

19、的干细胞分化和胚轴特化piRNA通路的突变基因首次被发现是在果蝇中，通过突变破坏卵子产生和胚轴特化 (Gillespie and Berg, 1995;Schupbach and Wieschaus, 1991)。果蝇的卵子发生始于胚胎干细胞分裂,产生一个成包囊细胞，这个成包囊细胞经过四次不完整的胞质分裂，产生16个有相互联系的细胞，一个卵母细胞和15营养细胞(for a review, see Spradling, 1993)。营养细胞为卵母细胞提供大部分的RNA和蛋白质成分，但是大部分仍然保持转录沉默。果蝇的胚轴特化取决于在卵母细胞中少数形态形成的RNA的不对称定位。这些RNA是从营养细胞

20、转移到卵母细胞的，它们是由交互与极化微管细胞骨架定位的。微管极化是由一连串的germline-to-soma和soma-to-germline信号控制的(reviewed by Grunert and St Johnston, 1996)。piRNA通路基因的突变破坏干细胞维持和卵母细胞生产,以及形态形成的RNA在卵母细胞胚轴特化期间的定位Chen et al., 2007; Cook et al.,2004; Cox et al., 1998; Cox et al., 2000; Gillespie and Berg, 1995; Lin and Spradling, 1997; Pane

21、et al., 2007; Schupbach and Wieschaus, 1991)。piwi基因编码的四种piwi类Argonautes家族(Cox et al., 1998)。piwi的突变导致在卵子发生时有严重缺陷,包括胚胎干细胞的损失(图3)( Cox et al., 1998; Cox et al., 2000; Lin and Spradling, 1997)。克隆的研究表明,在体细胞中，干细胞维持和分裂需要来自干细胞基因群的piwi的表达。相比之下，piwi在生殖系的损失,会降低细胞分裂效率,但不会导致失去干细胞或在卵子发生成团现象(Cox et al., 2000)。在其他

22、piRNA通路基因的中突变,包括西葫芦、南瓜、也会导致胚胎干细胞损失(Chen et al., 2007; Pane et al., 2007)。目前尚不清楚这些基因是否是必需的在生殖系细胞,体细胞或两者都有。piwi和piRNA通路以及生殖干细胞分裂和维持的分子功能尚未定义。在果蝇大多数的piRNA基因突变，包括茄子，纺锤丝 E，阿米蒂奇，漩涡，krimper，西葫芦，破坏的前后RNA定位(Cook et al., 2004; Gillespie and Berg, 1995; Pane et al., 2007; Schupbach and Wieschaus, 199

23、1). 这些变异不破坏前的bicoid mRNA定位或者不阻止卵母细胞的发展。因此,这些基因最初被认为是控制特定团体基因的表达，这些基因对于前后左右通路来说是必需的(Cook et al., 2004)。然而,后来的研究表明,引人注目的胚轴特化缺陷与piRNA相关突变是有关的，是DNA损伤信号的二次结果(Chen et al.,2007; Klattenhoff et al., 2007; Pane et al., 2007)。这些研究表明，piRNAs主要功能在维持胚胎DNA的完整性。piRNAs和DNA损伤信号之间的联系是由果蝇减数分裂DNA修复基因的研究得来的。减数分裂重组需要DNA断裂

24、形成的Spol1核酸酶(Cao et al., 1990 ),Schupbach和他的同事们已经表明,破坏减数分裂DNA断裂修复的突变,也会破坏前后和背腹胚轴特化(Abdu et al., 2002; Ghabrial et al., 1998)。值得注意的是,果蝇的胚胎发育缺陷通过mei-41和mnk(也称为loki-果蝇)中的突变与显著抑制的修复突变有联系, mei-41和mnk各自地编码ATR和chk2 kinases,这是在DNA损伤信号中的功能,并通过mei-W68的突变(Abdu et al., 2002; Ghabrial et al., 1998)编码the fly

25、Spo11 homolog(McKim和Hayashi-Hagihara,1998)。未修复的减数分裂突变出现激活ATR和Chk2 kinases,这也反过来触发胚轴特化缺陷。最近的研究表明，胚轴特化影响在 阿米蒂奇，茄子，西葫芦的缺陷，也会受到mei-41 和mnk的抑制(Chen et al., 2007; Klattenhoff et al., 2007; Pane et al., 2007)。此外，rmitage，茄子和纺锤丝 E基因突变导致H2Av (-H2Av) 磷酸化蛋白在胚胎细胞核的显著积累(fig。3 b);这些焦点通常与破坏DNA双链联系在一起 (Mod

26、esti Kanaar,2001)。值得注意的是, mei-W68(Spo11)没有受到抑制是与 armitage或-H2Av foci 的形成相关联的 (Klattenhoff et al .,2007)。piRNA突变,如DNA修复基因突变,从而通过活化ATR/Chk2 通路破坏胚轴特化。然而,与DNA修复通路突变不同,减数分裂不是损害的来源。所有的果蝇piRNA通路的突变导反转录转座子的超表达(Aravin et al., 2001; Chen et al., 2007; Kalmykova et al., 2005; Pane et al., 2007; Sarot

27、 et al., 2004; Vagin et al., 2006)，在男性生殖系中piwi突变体已被证明至少转移一类转座子(Kalmykova et al .,2005)。反转录转座子转移可以引起DNA损伤(Belgnaoui et al .,2006;Gasior et al .,2006),和在piRNA突变体中转座子高效率插入，这个可以破坏DNA修复机制，导致激活ATR和Chk2。然而，没有直接证据证明在女性生殖细胞系中的转座子转移，当piRNA通路部分被破坏的时候，会有转座子转移，并且这个途径可以更直接参与DNA修复，或者建立染色质结构抵抗伤害。果蝇染色体端粒是由逆转录转座子重复组成

28、,piRNA突变会增加这些重复的数量(Savitsky et al .,2006)。这些发现表明,piRNA突变可能导致端粒的保护的损失，导致识别染色体末端的DNA断裂。然而，目前尚不清楚piRNA通路突变的部分破坏是随机的，连接到转座子插入，或者受到特殊染色体域的限制，RNA的精确功能在维持胚胎基因组完整性仍有待确定。Oskar 蛋白质对于极点等离子组装和胚胎模式来说是必不可少的，并且 piRNA通路突变破坏osk mRNA 和蛋白质定位(Cook et al., 2004)。osk mRNA的转化以及与它极点定位紧紧的联系在一起，它开始于卵子发生的第九阶段(Kim-Ha

29、 et al .,1995;Markussen et al .,1995;Rongo et al .,1995)。在大量piRNA通路突变中的突变导致在前期卵子发生中的Oskar 蛋白质表达，并且mnk (Chk2)的突变不会抑制过早的（不成熟）的 osk mRNA的转化(Cook et al.,2004; Pane et al., 2007)。因此,过早的（不成熟的）Osk 蛋白质积累不是DNA损伤信号的结果。Piwi-class-Argonaute-piRNA混合物，就像siRNA or miRNA Argonaute家族的混合物，能够在试管内完美的切开RNA目标体(Gunawa

30、rdane et al., 2007; Lau et al., 2006; Saito et al., 2006)。如上所述，miRNA-Argonaute复合物不能完美的与作为mRNAs 诱导转化沉默的目标相配对(Valencia-Sanchez et al . ,2006)。也因此piRNA-Piwi-class-Argonaute复合物可能触发的转座子沉默形成 不完美匹配的目标,包括单份基因mRNA如oskar。符合这个猜测的是piRNAs的一个通路与小鼠的多糖体之间的联系(Grivna et al .,2006 b)。雄性果蝇中生殖能力和放射性沉默大多数果蝇的piRNA通路突

31、变都会降低，这与放射状蛋白的过表达相关，放射状蛋白的功能尚不清楚，它由X染色体上的多重基因编码，这些基因被Y染色体连锁的放射基因座抑制基因Su(Ste) 所抑制，Su(Ste)包含与放射状蛋白高度同源的双向转录重复序列，Su(Ste) 基因座的缺失会导致放射状蛋白的超表达，并在睾丸中组装成晶体，25-27 nt 的piRNAs产生于Su(Ste) 基因座，piRNA通路的突变会导致放射状晶体的形成，来自于Su(Ste)基因座的piRNA会导致放射状蛋白的沉默，尚不清楚这是否反映了转录或后转录的沉默。放射状蛋白的单独过表达会导致不育，缺点是其他基因的沉默也会导致雄性生育性。在雄性生殖系，piRN

32、A通路突变导致至少一个子集的转座子的移动，与转座子活化相关的插入突变也会导致生殖力的下降。老鼠的雄性生殖系的发育老鼠的基因组编码三个Piwi同源染色体，Miwi, Miwi2 和Mili (也分别称为Piwil1, Piwil4 和 Piwil2）这三个在睾丸中表达量都很高，结合的piRNAs的Mili 和 Miwi 、Mili 和 Miwi敲除的突变体都会阻碍piRNAs的产生，三者中每个基因的单一无效突变都会导致雄性不育，老鼠的精子形成是一个协调的过程，可以分成三个阶段：有丝分裂、减数分裂和精子形成。在第一阶段中，上皮细胞的基底层干细胞的内部化使得有丝分裂自动更新，并形成一群初级精母细胞；

33、在第二阶段中，初级精母细胞通过减数分裂继续发育，并形成单倍体圆形精细胞。在减数分裂前期I的细线期，重复的染色体浓缩并开始形成对，配对完成后，在偶线期，形成联会复合体，并在粗线期发生交换。双线期，同源染色体开始分开，最后在浓缩期消退。在第三阶段，圆形精细胞成熟并伸长，然后释放到小管腔中，在Mili, Miwi 和 Miwi2 突变体中，睾丸产后约2周内是正常的，大致与第一轮减数分裂期相同，然而，后减数分裂的细胞并没有形成（图3C），在粗线期，Mili 和 Miwi2 突变体的发育受阻,而Miwi 突变体的精母细胞发育到一个圆形精母细胞阶段，但并不形成精子。与Mili和Miwi 蛋白时空表达模式相

34、关的发育时间受限，在雄性原生生殖细胞中，Mili是第一个发现的，并出现在粗线期的整个阶段，Miwi只在粗线期中间阶段到圆的精细胞间表达，精子形成期的Miwi2的时空表达模式尚未报道。每个基因的突变会导致雄性生殖细胞的退化，而体细胞的影响不大，在染色体联会被破坏和DNA损伤修复的突变体中存在类似的精子形成抑制表型。此外-H2AX染色很深，表明在Miwi2突变体中可观察到DNA的断裂，上述结果表明，老鼠中piwi突变，正如果蝇piRNA通路的突变，会导致DNA的损伤，并激活DNA损伤的应答，包括生殖系细胞的凋亡变性。在果蝇piRNA通路的突变体中，生殖系细胞的DNA损伤与逆转录转座子超表达相关，大多数piRNAs与逆转录转座子和重复序列相联系。这些观察表明，转座子的移动导致生殖系细胞的DNA损伤，尽管还未得到证明。相反，成年老鼠睾丸中的piRNAs 耗尽了逆转录转座子和重复序列。然而，最新的研究鉴别了粗线期前的包含括大量重复和逆转录转座子序列的Mili相关的piRNAs，此外，老鼠的Mili 和 Miwi2 突变体逆转录转座子转录的消阻遏作用。因此 piRNA pathway 在沉默逆转录转座子过程中具有保守功能，并防止生殖细胞系中的DNA损伤。与苍蝇形成对比，在老鼠 Piwi 类 Argonaute基因上，雌性生殖细胞系并不受单突变的影响。在哺乳动物雌