全内反射光显微镜

1、全内反射荧光显微镜医学实验05级张园张园 郑雪飞郑雪飞 宋一萌宋一萌 解解依荻依荻发展历史优势应用分型及结构基本原理基本原理发展与展望发展与展望发展历史 发展历史 在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题：微中的几个重要问题： 1. 1.显微图像的显微图像的信噪比信噪比不高；不高； 2.2.光源对生物样本照射的损伤；光源对生物样本照射的损伤； 3.3.光学衍射所致的光学衍射所致的分辨极限分辨极限（r 0. 61/nsinr 0. 61/nsin）：）： 传统的光学显微镜由于受到传统的光学显微镜由于受到光瞳远场

2、衍射效应光瞳远场衍射效应的影响的影响, ,存在分辨极限存在分辨极限, ,瑞利将之归纳为瑞利将之归纳为r 0. 61/nsin(u/2)r 0. 61/nsin(u/2) , ,其中其中r为分辨为分辨力力 ,为成像光波波长为成像光波波长, nsin(u/2), nsin(u/2)为物透镜的为物透镜的数值孔径数值孔径, ,即即na na 值，值，u为为孔径角孔径角,因此光学显微镜空间分辨极限因此光学显微镜空间分辨极限250 nm250 nm。发展历史 hirsch fieldhirsch field完成了完成了第一个第一个全内反射全内反射荧光实验荧光实验19651965年年axelrodaxelr

3、od等生物物理等生物物理学家对学家对trifmtrifm技术技术及基本原理进行描及基本原理进行描述，并探索了其生述，并探索了其生物应用。物应用。 20世世纪纪20世世纪纪9090年代年代新型物镜透镜、聚光新型物镜透镜、聚光镜和超灵敏探测器的镜和超灵敏探测器的出现，使出现，使trifmtrifm技术技术得到充分发展。得到充分发展。19951995年年yanagidayanagida小小组用组用tirfmtirfm技技术首次在液体术首次在液体溶液中得到了溶液中得到了荧光标记的单荧光标记的单个蛋白质分子个蛋白质分子的成像。的成像。该项技术已经应用到该项技术已经应用到许多单分子的研究中许多单分子的研究

4、中19961996年年moernermoerner小组小组又用这项技术又用这项技术实现了限制在实现了限制在丙烯酰胺胶体丙烯酰胺胶体的纳米孔中的的纳米孔中的单分子的三维单分子的三维成像。成像。至今至今基本原理基本原理全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本设计思路的基本设计思路全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本原理的基本原理 全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波激发样品激发样品, ,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发到激发, ,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，荧光成像

5、的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现100nm100nm甚至更低的空间分辨率。甚至更低的空间分辨率。基本原理基本原理全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本设计思路的基本设计思路全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本原理的基本原理荧光激发原理荧光激发原理荧光捕捉原理荧光捕捉原理snellsnell定律定律: :n1sin 1=n2 sin 2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:2=90 c=sin-1

6、(n2/n1) 即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射荧光激发原理荧光激发原理沿着入射面上的介质边界传播在平行界面方向以平行波场方式传播在垂直界面方向则是呈指数衰减。 隐失波的强度-深度图荧光激发原理荧光激发原理非均匀波 t12（i）- 分界面处的透射强度分界面处的透射强度d 12 - 渗透深度渗透深度i - 入射角入射角 - 入射光波长入射光波长对于可见光波长380 780nm而言，浸透深度为100nm。荧光激发原理荧光激发原理箭头箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。黄色小圆点黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子，白色小圆点白色小圆点表示未被激发的荧光分

7、子。荧光捕捉原理荧光捕捉原理ccd相机 ccd相机的特点使全内反射荧光显微镜利用消逝波照射样品并使其成像成为可能，也成就了其高信噪比。 ccd相机的特点提高了其时间分辨率，使得观察单分子的运动、细胞物质的分泌、蛋白质的相互作用成为可能并成为这方面的优势观察仪器。 目前使用ccd 探测,可达到的量子产率已到80 % ,成像速率200 hz.当对活细胞成像时,为了达到单分子级的灵敏度或是为了减少曝光时间,需要采用图像增强器。荧光捕捉原理荧光捕捉原理两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。 棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上，它也不容易受到

8、入射光信号的干扰。放置样品的空间受到棱镜的限制。棱镜型全内反射荧光显微镜 物镜型全内反射荧光显微镜利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。 the application of the total internal reflection fluorescence microscopy解依荻全内反射应用的核心问题全内反射应用的核心问题共焦技术共焦技术 vs.vs.全内反射技术全内反射技术l共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析深度分别为500800nm。l全内反射显微术: 典型的垂直照明深度100nm。l结论：薄的光学层析层切片信噪比强； 细胞的光损伤和光漂白影响也很小。全内反射的应用

9、全内反射的应用l在生物单分子研究中的应用l直接观察细胞表面的生命活动,而不受细胞深层区域信号的干扰.l全内反射荧光显微术的荧光激发深度只在200的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。全内反射的应用比较全内反射的应用比较l与其他生物单分子研究技术的比较全内反射荧光显微镜（tirfm）共聚焦激光扫描显微镜（clsm）双光子激光扫描显微镜（tplsm）全内反射的应用比较全内反射的应用比较l全内角反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope，tirfm），利用光线全反射后在介质

10、另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。 全内反射的应用比较全内反射的应用比较和则是可以检测细胞质内荧光的技术。lclsm的重要优势在于，它提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大约为500-800nm，要大于全内反射荧光显微镜的光学薄层的厚度（200nm）

11、。ltplsm对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率，如细胞器，细胞连接，细胞内钙离子浓度，细胞膜流动性。 生物单分子荧光检测技术的比较生物单分子荧光检测技术的比较共聚焦激光扫描显微（clsm）双光子激光扫描显微镜（tplsm）全内反射荧光显微镜（tirfm）共同点检测细胞荧光物质的技术空间分辨荧光分析技术区别点clsm提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。不要求高于衍射极限的分辨率 tplsm对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率。双光子激发能探索活细胞内各种分子的实时动态，能实现在样品

12、中的高度精确定位。减少了光损伤，特别对需要条件温和的生物体系有利tirfm具有高度的界面（表面）特异性，可有效排除本体干扰，获取界面信息。纵向分辨力极高，特别适用于表面或界面单分子的测定。全内反射荧光法相对简单，费用低廉。表面或界面单分子的测定展望前景展望前景l不论是对物理成像学家还是对细胞生物学家而言，全内反射荧光显微术均是一项新的技术。它的未来发展将是怎样的呢？l它将向着两个前沿方向发展：技术上的进一步创新和在新的细胞生命科学领域中的应用。这意味着在一方面全内反射荧光显微术将继续和其它的显微成像技术，如荧光相关光谱技术，荧光寿命成像技术以及原子力显微术相结合；另一方面，继续寻求成像原理上的

13、突破，这也正是目前有待积极探索的课题。全内反射荧光显微镜的改进全内反射荧光显微镜的改进1. 光电探测设备探测效率和探测速度的提高l新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入2. 单分子染色技术的发展新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l超高的信噪比，能够得到完美的超高的信噪比，能够得到完美的图像图像l崭新的uis2物镜的信噪比优越，高于现有物镜50%。这种物镜的新特性还包括精选了低自发荧光玻璃（通过全反射镀膜和连接材料，显著减少了自发荧光），提高了数值孔径，增强了信号亮度。uis2系统在弱激发光下，能够有效探测极弱荧光，从而建立了活细胞荧光成像的新标准。 新

14、型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l拥有更宽波长范围内的高透过率拥有更宽波长范围内的高透过率l内置物镜采用uw多层镀膜技术，能有效消除超宽谱带上的反射，在可见光到近红外光的波长范围内能够实现平坦的高透过率，在近红外和紫外范围内的透过率显著提高。提高较宽波长范围内的性能使它非常适合当今最需要的研究用途。 新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l有效消除直到近红外范围的色差有效消除直到近红外范围的色差l杰出的超级复消色差特点有效地消除了从可见光谱直到1000nm范围内的色差, 意味着从紫外到红外范围内的成像都可以只用一个

15、物镜实现。这一系列物镜在使用覆盖很宽谱带的荧光进行多色观察时，可以获得出色的清晰图像而不产生颜色偏移。 新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l双层多光口设计保证了输入双层多光口设计保证了输入/ /输出灵活性输出灵活性 新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l后上光口后上光口l后上光口不改变载物台高度，所以不影响镜架稳定性这一光口可做光路输入口，可装一个附加荧光照明器 l右侧光口右侧光口l右侧光口装置（ix2-rspc-2:可选件，视场数：16）带有一个结像透镜，可以安装一个c型接口ccd照相机。l后下光口后下光口l能够安装冷ccd dp30bw与同类设备。 l左侧光口左侧光口l在这一光口上，原始图像平面距显微镜镜架102mm，具有很大的灵活性，用以安装滤色镜转盘或者超低0.25x或5x照相机适配器。与双光口视频适配器结合，能够获得两个原始图像。（可选件） l底光口底光口使用ix2-tvr （t型接口），获得原始图像。 新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l提高了近红外透过率提高了近红外透过率lix2系列采用uis2 光学系统，提高了侧光口、后光口和底光口的红外透过