实验七DNA体外重组技术

1、仅供个人参考实验七 DNA体外重组技术一概念DNA重组：指不同来源的 DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基 因，在体外与载体 DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。二.基本过程For pers onal use only in study and research; not for commercial use分、切、连、转、筛1分：分离

2、出要克隆的目的基因及载体。 目的基因的来源：i。直接分离适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电泳分离 DNA，应用相应DNA探针确定目的DNA后，从胶中回收 DNA。ii。人工合成序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成。iii。由 mRNA逆转录合成 cDNA细胞总RNA分离 mRNA分离 目的基因mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成cDNA发卡环的消化cDNA的克隆iv。从基因组文库中筛选目的基因首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文库），需要时利用探

3、针技术将所需目的 基因“钓”出来。v。PCR 载体：可容忍外源性 DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。理想的质粒克隆载体应具有的特性：i 能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增i 具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点，即多克隆位点（MCS, multiple cloning sites）,便于进行克隆iii. 分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制V 易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、a -互补显色反应（蓝白斑筛选）v .表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件vi。生物安全性好目前常用的载体有质粒

4、、噬箘体、病毒等。2切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。3连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。4转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast,昆虫细胞或哺乳动物细胞）。5筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将 带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。 实验质粒DNA提取一原理1定义独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链 DNA分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性Ampr等。2. 来源存在于细菌、放

5、线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。3分类质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒 严紧型质粒（Stringent control）严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒，如F因子。 松弛型质粒（Relaxed control）松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上,如Col质粒。松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的 酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时

6、，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。4.构型质粒构型：超螺旋型（SC）,开环形（0C）,线型（LC）加样孔皈H oc SC5碱裂解法提取质粒原理碱裂解法提取质粒 DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的分子大小和结构差异来实现分离的。在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒 DNA虽然H键也发生断裂， 但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入 pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒 DNA迅速复性，染色体 DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。质粒DNA染色

7、体DNA分子量小(1.5kb 15kb 或 60kb 120kb)大结构超螺旋，共价，闭环线性，双螺旋变性 pH> 12.6氢键断裂，两条互补链不完全分离双螺旋完全打开复性 pH中性恢复原始构象不能复性二.实验试剂溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris-CI(pH 8.0)10mmol/L EDTA(pH 8.0) 溶液n0.4moI/L NaOH 2%SDS临用前1:1混合贮存液即为II液.溶液川60ml11.5ml28.5ml (最终 pH4.8)5mol/L醋酸钾冰醋酸水三.操作步骤1. 10,000g,1min离心收集1.5- 5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

8、2. 加入100川溶液1,振荡至彻底悬浮。3. 加入200川溶液2,立即轻柔颠倒离心管 6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150川溶液3,立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10, 000g离心10min。5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10, 000g离心5min。6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5- 10min，沉降DNA7. 10, 000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入 1ml 70 %的乙醇洗涤沉淀，10, 000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸

9、吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含 RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒 DNA10. 取适量体积的质粒 DNA进行电泳检测不得用于商业用途仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uni

10、quementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to员bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ymoiflCH6yHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 员 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 员 ex.以下无正文仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forsch

11、ung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to员bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ygoiccH6yHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 员 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 员 ex.For personal use only in study and research; not for commercial use以下无正文仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerieel Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude