生物化学技术2沉淀法

1、第二章第二章 沉沉 淀淀 法法 沉淀法是分离纯化生命大分子物质常用的一种经典沉淀法是分离纯化生命大分子物质常用的一种经典方法；其特点是：操作简单，成本低廉方法；其特点是：操作简单，成本低廉 常见的方法有常见的方法有盐析、有机溶剂沉淀、蛋白质沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、蛋白质沉淀、peg沉淀、选择性沉淀、结晶沉淀等沉淀、选择性沉淀、结晶沉淀等掌握沉淀法的基本原理及影响因素掌握沉淀法的基本原理及影响因素掌握沉淀类型及其在制备蛋白质、核酸中作用原理掌握沉淀类型及其在制备蛋白质、核酸中作用原理熟悉沉淀法在制备蛋白质和核酸过程中的实际运用熟悉沉淀法在制备蛋白质和核酸过程中的实际运用 目目 的的第一节第一节

2、 基本原理与沉淀类型基本原理与沉淀类型一、基本原理一、基本原理 根据同一溶剂中有效成分与杂质溶解度差异。选用某根据同一溶剂中有效成分与杂质溶解度差异。选用某种溶液系统，使所需有效成分出现最大溶解度，而杂质出种溶液系统，使所需有效成分出现最大溶解度，而杂质出现最小溶解度；或者相反，然后溶解度小者以沉淀的形式现最小溶解度；或者相反，然后溶解度小者以沉淀的形式析出，达到有效成分与杂质分离的目的析出，达到有效成分与杂质分离的目的 根据蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面的明显根据蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面的明显差异，所以从生物材料中提取制备这两类物质，一般选用差异，所以从生物材料中提取制备这

3、两类物质，一般选用的试剂和操作方法也不完全相同的试剂和操作方法也不完全相同二、制备蛋白质二、制备蛋白质（一）盐析法（一）盐析法1.原理原理 蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的增高而上升蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的增高而上升（盐溶）（盐溶）；但当盐浓度增加到一定数值时，其溶解度；但当盐浓度增加到一定数值时，其溶解度有随盐浓度逐渐下降，直至蛋白质析出有随盐浓度逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）（盐析） 盐析的内因是当盐浓度达到一定程度时，水的盐析的内因是当盐浓度达到一定程度时，水的活度降低，导致蛋白质分子活度降低，导致蛋白质分子表面电荷表面电荷中和，中和，水化膜水化膜相继破坏，蛋白质分子聚

4、集而析出沉淀相继破坏，蛋白质分子聚集而析出沉淀2.2.基本步骤基本步骤选择一定浓度的盐溶液，使部分杂质选择一定浓度的盐溶液，使部分杂质“盐析盐析”，有效成分，有效成分“盐盐溶溶”（0 025%25%的（的（nhnh4 4）2 2soso4 4）离心分离上清离心分离上清再调一定浓度盐（再调一定浓度盐（252560%60%饱和盐溶液），使有效成分饱和盐溶液），使有效成分“盐析盐析” ” 离心收集沉淀物，即为初步纯化的有效成分离心收集沉淀物，即为初步纯化的有效成分（1）盐分级沉淀）盐分级沉淀盐的选择：盐的选择：在蛋白质盐析时，常选用的盐是在蛋白质盐析时，常选用的盐是（nhnh4 4）2 2soso4

5、 4u（nhnh4 4）2 2soso4 4的优点：的优点：溶解度大；对温度不敏感；分离效果溶解度大；对温度不敏感；分离效果好（如有时一次可除去好（如有时一次可除去75%的杂蛋白）；的杂蛋白）； （nhnh4 4）2 2soso4 4本身本身有稳定蛋白质结构的作用；价格低廉；废液还可作肥料有稳定蛋白质结构的作用；价格低廉；废液还可作肥料u缺点：缺点：与其他盐一样，若需进一步纯化，需脱盐处理与其他盐一样，若需进一步纯化，需脱盐处理 （nhnh4 4）2 2soso4 4盐析盐析 固体法固体法在大体积的粗提液中逐渐加入固体在大体积的粗提液中逐渐加入固体（nhnh4 4）2 2soso4 4，边，边

6、加边搅拌，缓缓加入。在此过程中，溶液加边搅拌，缓缓加入。在此过程中，溶液（nhnh4 4）2 2soso4 4的浓度不断升高，水分子不断与的浓度不断升高，水分子不断与（nhnh4 4）2 2soso4 4结合，结合，当加入的（当加入的（nhnh4 4）2 2soso4 4达到盐析点时，蛋白质就会沉达到盐析点时，蛋白质就会沉淀出来淀出来例：例：在尿素酶抽提液中加入在尿素酶抽提液中加入（nhnh4 4）2 2soso4 4，当饱和度达为，当饱和度达为35%时，尿素时，尿素酶基本留在溶液中；但当饱和度达到酶基本留在溶液中；但当饱和度达到55%时，尿素酶几乎全部沉淀时，尿素酶几乎全部沉淀 至于蛋白质溶

7、液中加多少至于蛋白质溶液中加多少（nhnh4 4）2 2soso4 4使其饱和度符合蛋白质盐析，使其饱和度符合蛋白质盐析，可查表可查表2-2，或用下列公式计算：，或用下列公式计算：2123 . 0100)(533sssg2123 . 0100)(541sssg（20）（25 ）g表示一升溶液中需加入的表示一升溶液中需加入的（nhnh4 4）2 2soso4 4的克数的克数硫硫 酸酸 铵铵 对对 尿尿 素素 酶酶 的的 沉沉 淀淀 作作 用用调调 整整 硫硫 酸酸 铵铵 溶溶 液液 饱饱 和和 度度 计计 算算 表表饱和溶液法饱和溶液法 在在pro溶液中加入预先调好的饱和溶液中加入预先调好的饱和

8、（nhnh4 4）2 2soso4 4溶溶液，不同的饱和度所需的液，不同的饱和度所需的（nhnh4 4）2 2soso4 4的量用下式的量用下式计算：计算：23120ssssvv1s0vv2s3s表示需加入表示需加入（nhnh4 4）2 2soso4 4溶液的体积（溶液的体积（ml）表示原来溶液的体积表示原来溶液的体积表示始、终盐的饱和度表示始、终盐的饱和度表示需加入表示需加入（nhnh4 4）2 2soso4 4溶液的饱和度溶液的饱和度 此法较固体法此法较固体法温和温和，但不宜用于大体积样品；否则引，但不宜用于大体积样品；否则引起样品液体积增加，计算不准确。不能达到预期的目的起样品液体积增加

9、，计算不准确。不能达到预期的目的透吸法透吸法 将装有将装有propro溶液的透吸袋放入一定浓度大体积盐溶液中，溶液的透吸袋放入一定浓度大体积盐溶液中，利用半透膜透吸改变利用半透膜透吸改变propro溶液中的盐浓度溶液中的盐浓度 由于此法的盐浓度是以连续状态变化的，可由于此法的盐浓度是以连续状态变化的，可避免避免局部盐浓度过高局部盐浓度过高而产生的不良影响；所以分离效果好而产生的不良影响；所以分离效果好 但透吸袋体积有限，盐析速度缓慢，（但透吸袋体积有限，盐析速度缓慢，（nhnh4 4）2 2soso4 4消耗多等原因，致使此法仅用于要求较精确、样品体消耗多等原因，致使此法仅用于要求较精确、样品

10、体积小的试验过程中，难于放大积小的试验过程中，难于放大（2 2）制作盐析曲线）制作盐析曲线 用盐析法沉淀分离用盐析法沉淀分离pro样品是，样品是，（nhnh4 4）2 2soso4 4的的“盐析盐析”浓度很关键，所需的浓度很关键，所需的浓度范围要通过具体试验确定：浓度范围要通过具体试验确定：u取一定体积已测含量的取一定体积已测含量的pro或酶的待分离溶液，调或酶的待分离溶液，调ph至稳定范围至稳定范围u分分610次加入不同量的次加入不同量的（nhnh4 4）2 2soso4 4至出现浑浊时，分离上清；如此反复至出现浑浊时，分离上清；如此反复610次，分别收集每次的沉淀次，分别收集每次的沉淀u根

11、据每次沉淀的根据每次沉淀的pro或酶的量和相应的或酶的量和相应的（nhnh4 4）2 2soso4 4浓度之间作图，即得盐析曲浓度之间作图，即得盐析曲线（如图线（如图2-1）u参照表参照表2-3的分级试验方法，再根据所用生物材料来源的难易程度，以及对有的分级试验方法，再根据所用生物材料来源的难易程度，以及对有效成分纯度和得率的要求，先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致框架，然后效成分纯度和得率的要求，先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致框架，然后经过反复试验就能确定最佳盐析范围（即经过反复试验就能确定最佳盐析范围（即（nhnh4 4）2 2soso4 4 的浓度范围）的浓度范围） 但若生物材料

12、来源容易，主要考虑提高纯化倍数，得率高低可视为次要因数，但若生物材料来源容易，主要考虑提高纯化倍数，得率高低可视为次要因数，若材料来源困难，则主要考虑得率若材料来源困难，则主要考虑得率 典典 型型 盐盐 析析 曲曲 线线 由表可知，若生物材料来源容易，主要是考虑提高纯化倍由表可知，若生物材料来源容易，主要是考虑提高纯化倍数时，选择数时，选择48%65%盐饱和分级范围，酶的纯化倍数可达盐饱和分级范围，酶的纯化倍数可达3.0，而得率仅为而得率仅为75%；若生物材料来源较困难，主要是考虑提高收得；若生物材料来源较困难，主要是考虑提高收得率时，则选择率时，则选择45%70%甚至甚至45%75%盐饱和分

13、级范围，酶的收盐饱和分级范围，酶的收得率可达得率可达80%以上，而纯化倍数将以上，而纯化倍数将2.4（3 3）影响盐析的因素）影响盐析的因素盐析常数（盐析常数（ks）每种每种pro在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在如下关系在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在如下关系 s表示有效成分在水中的溶解度表示有效成分在水中的溶解度; m表示摩尔浓度表示摩尔浓度; ks表示有效成分在特定条件下的恒定值表示有效成分在特定条件下的恒定值mksslg ks值越大值越大,则意味着有效成分溶解度降低的速度随着盐浓度则意味着有效成分溶解度降低的速度随着盐浓度的增加而快速降低的增加而快速降低;因此因此,对一种

14、有效成分而言对一种有效成分而言, ks值越大，分值越大，分级范围就越窄，盐析效果就越好。级范围就越窄，盐析效果就越好。 ks还受还受pro本身的性质、本身的性质、溶液的溶液的ph、温度及盐的种类等因素的影响、温度及盐的种类等因素的影响 在在ph7.0溶液中几种蛋白质的溶液中几种蛋白质的和和ks常数常数（溶解度（溶解度s以以mg/ml表示）表示）盐分级范围的差异性盐分级范围的差异性 在在pro分离过程中，若每一种分离过程中，若每一种pro的的ks都很大，分离效果都很大，分离效果不一定好。因为盐析效果还与盐析范围的差异性有关不一定好。因为盐析效果还与盐析范围的差异性有关各各pro的的ks大大 +

15、盐析范围差异明显，则分离效果好；盐析范围差异明显，则分离效果好； 如图如图2-2中中ac各各pro的的ks大大 + 盐析范围差异较小，则分离效果不好；如盐析范围差异较小，则分离效果不好；如图图2-2中中ab ph和盐浓度和盐浓度有效成分的溶解度会受到有效成分的溶解度会受到ph和盐浓度的显著影响和盐浓度的显著影响例：例：兔肌磷酸甘油醛脱氢酶（兔肌磷酸甘油醛脱氢酶（ pi约约8.5）可溶于）可溶于ph6.0，3.2mmol/l的的（nhnh4 4）soso4 4溶液中，但若调节溶液中，但若调节ph.，则立即，则立即产生沉淀这说明选择适当产生沉淀这说明选择适当ph的盐溶液可提高盐析的效果的盐溶液可提

16、高盐析的效果 一般来说，在分级盐析过程中，第一次盐析时（除去杂质），一般来说，在分级盐析过程中，第一次盐析时（除去杂质），ph应偏离有效成分的应偏离有效成分的pi值，而接近杂质的值，而接近杂质的pi值；而在第二次盐析值；而在第二次盐析时（沉淀有效成分），时（沉淀有效成分），ph应调节至接近有效成分的应调节至接近有效成分的pi值值蛋白质的纯度和浓度蛋白质的纯度和浓度 蛋白质存在的形式（均一的还是混合的）和浓度不同，蛋白质存在的形式（均一的还是混合的）和浓度不同，盐析范围和溶解度也不一样。在混合的盐析范围和溶解度也不一样。在混合的pro溶液中，不同溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀作用。分子

17、间的相互作用会发生共沉淀作用。 pro浓度越高，这浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果则越差；因此，一般控制样种现象越明显，盐析分离效果则越差；因此，一般控制样品液品液pro浓度在浓度在0.22%之间为宜之间为宜其他其他 在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加1mmol/l的的edta-na2盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。另外，盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。另外，加加（nhnh4 4）2 2soso4 4沉淀的时间要控制好，过长或过短都不宜，沉淀的时间要控制好，过长或过短都不宜，一般控制在一般控制在2h左右左右（4）脱盐）脱盐常用方法：常用方法：凝胶过滤

18、法和透析法凝胶过滤法和透析法u透析操作的注意事项：透析操作的注意事项：透析袋处理透析袋处理：市售透析袋要：市售透析袋要d.w洗净，检查无漏洞时再用。洗净，检查无漏洞时再用。若用来去除某些易被金属离子或水解酶破坏的样品中的盐若用来去除某些易被金属离子或水解酶破坏的样品中的盐时，透析袋应用含时，透析袋应用含edta-na2的的nahco3溶液中煮沸溶液中煮沸10min；并经；并经d.w煮沸、漂洗后再用煮沸、漂洗后再用透析液的选择透析液的选择：透析液一般为低离子强度的中性缓冲液。：透析液一般为低离子强度的中性缓冲液。对含有辅基的酶透析时，宜在透析液中加入适量的辅基或对含有辅基的酶透析时，宜在透析液中

19、加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为防止微生物的生长，透析应在保护辅基的试剂。为防止微生物的生长，透析应在4进行进行或在透析液中添加或在透析液中添加0.02%的的nan3( (二二) )有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法1.原理原理与盐溶液一样具有脱水作用，使与盐溶液一样具有脱水作用，使pro表面的水化膜破坏表面的水化膜破坏降低溶剂系统的介电常数，即降低极性（而蛋白质为水降低溶剂系统的介电常数，即降低极性（而蛋白质为水溶性物质）溶性物质）2.常用有机溶剂：常用有机溶剂：meoh、etoh、me2co等等3.有机溶剂的使用量：有机溶剂的使用量： 2120scssvvv v表示加入有机溶剂的体积；表示加入

20、有机溶剂的体积； v v0 0表示蛋白溶液的原始体积表示蛋白溶液的原始体积s s1 1表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度( (体积百分浓度体积百分浓度) )s s2 2表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度( (体积百分浓度体积百分浓度) )c c表示有机溶剂的浓度（如无水表示有机溶剂的浓度（如无水etoh ，则，则c=100，95% etoh ，则，则c=95） 4.注意事项：注意事项：中性盐作用。即在有机溶剂沉淀时，加入适量中性盐，一方中性盐作用。即在有机溶剂沉淀时，加入适量中性盐，一方面可增加面可增加pro在有机溶剂中的溶解度，另一方面

21、可防止在有机溶剂中的溶解度，另一方面可防止pro变性变性（0.05）；提高分级效果）；提高分级效果低温下操作。因为有机溶剂加入水溶剂中会放热，若不注意低温下操作。因为有机溶剂加入水溶剂中会放热，若不注意降温，容易导致降温，容易导致pro变性变性多价阳离子作用。有些多价阳离子作用。有些pro能和多价阳离子（如能和多价阳离子（如zn+、cu+等等）结合形成复合物，致使结合形成复合物，致使pro在有机溶剂中溶解度降低，这对在在有机溶剂中溶解度降低，这对在高浓度溶剂中才能沉淀的高浓度溶剂中才能沉淀的pro特别有益。如在某些特别有益。如在某些pro溶液中加溶液中加入入0.0050.02mmol/l的的z

22、n+，就可节省大量有机溶剂，就可节省大量有机溶剂， 使使pro有效得沉淀出来有效得沉淀出来（三）蛋白质沉淀法（三）蛋白质沉淀法1.碱性蛋白质碱性蛋白质（多价阳离子的碱性蛋白质）（多价阳离子的碱性蛋白质）如：鱼精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀如：鱼精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀prou应用：应用：鱼精蛋白加入到部分纯化的酵母鱼精蛋白加入到部分纯化的酵母pfk溶液时，溶液溶液时，溶液中的酶蛋白便会吸附到鱼精蛋白中的酶蛋白便会吸附到鱼精蛋白核酸沉淀物上；将沉淀物核酸沉淀物上；将沉淀物用用0.1mol/l磷酸缓冲液洗脱，收集的磷酸缓冲液洗脱，收集的pfk纯度提高了纯度提高了9倍倍 从深红螺菌

23、中分离从深红螺菌中分离pep羟基激酶时，加鱼精蛋白处羟基激酶时，加鱼精蛋白处理，可除去其中理，可除去其中3/4的杂蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中的杂蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中u缺点：缺点：多价阳离子的碱性蛋白质不可再利用，且其水溶液多价阳离子的碱性蛋白质不可再利用，且其水溶液ph23，要小心调中性后才能应用，要小心调中性后才能应用2.凝集素凝集素 目前研究得比较清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，目前研究得比较清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，它是一种特殊的蛋白质，主要对糖蛋白糖链末端序列有特异、明它是一种特殊的蛋白质，主要对糖蛋白糖链末端序列有特异、明显的凝集力显的凝集力例：例：伴

24、刀豆蛋白伴刀豆蛋白对含有对含有g、甘露糖、甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异等分子的糖蛋白能发生特异凝集沉淀作用，通过离心可把糖蛋白与一般蛋白质分离开，获得凝集沉淀作用，通过离心可把糖蛋白与一般蛋白质分离开，获得的凝集素的凝集素-糖蛋白复合物用单糖作抑制剂即可解离糖蛋白复合物用单糖作抑制剂即可解离优点：优点：条件温和，专一性强条件温和，专一性强3.重金属重金属 重金属（重金属（pbpb2+2+、hghg2+2+）也能与蛋白质沉淀，纯化）也能与蛋白质沉淀，纯化pro。但由于重。但由于重金属易使金属易使pro变性，故应用时要控制在较温和的条件下进行，并变性，故应用时要控制在较温和的条件下进行，并及时除

25、去重金属及时除去重金属(四四)pegpeg沉淀法沉淀法 此法应用较广此法应用较广,属于非离子型聚合物引起的属于非离子型聚合物引起的pro沉淀作用沉淀作用;沉淀条件温和，不易引起沉淀条件温和，不易引起pro变性，且沉淀较完全变性，且沉淀较完全 如用如用20%peg-6000或或57%peg-400可使可使-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶80%发生沉淀发生沉淀（五）选择性沉淀（五）选择性沉淀 利用目的利用目的pro与杂与杂pro在不同物理化学环境下的稳定性在不同物理化学环境下的稳定性不同（如温度、酸碱度、有机溶剂等），用选择性沉淀法，不同（如温度、酸碱度、有机溶剂等），用选择性沉淀法，使杂使杂pro变性沉淀

26、，而目的变性沉淀，而目的pro存在于溶液中或发生可逆性存在于溶液中或发生可逆性沉淀，从而使目的沉淀，从而使目的pro得到纯化得到纯化例：例：酵母干粉抽提液升温至酵母干粉抽提液升温至55，20min后迅速冷却，后迅速冷却，离心除去热变性的离心除去热变性的pro，上清液中为对热稳定的醇脱氢酶，上清液中为对热稳定的醇脱氢酶 假单胞菌培养液中加假单胞菌培养液中加 hcl 调调phph至至4.0，得到碱性脂酶，得到碱性脂酶的沉淀的沉淀（六）结晶沉淀法（六）结晶沉淀法操作：操作：将欲结晶的物质溶解于适当溶剂中，加入适量的盐将欲结晶的物质溶解于适当溶剂中，加入适量的盐（如（如202040% 40% （nhn

27、h4 4）2 2soso4 4 ）或有机溶剂（如）或有机溶剂（如etohetoh、meohmeoh等），使其溶解度降低至接近饱和的等），使其溶解度降低至接近饱和的临界浓度或刚刚开始出现沉淀临界浓度或刚刚开始出现沉淀调节调节phph至等电点附近，控制温度至等电点附近，控制温度44左右，使溶解度进一步降低左右，使溶解度进一步降低放置一段时间（陈化），即可得到结晶沉淀放置一段时间（陈化），即可得到结晶沉淀 对于难结晶的物质，有时采用加入少量对于难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种晶种”引子，或进行适当搅引子，或进行适当搅拌，或在容器拌，或在容器 壁上用玻棒磨檫等方法，可加速结晶壁上用玻棒磨檫等方法，

28、可加速结晶三、制备核酸三、制备核酸 从生物材料（如动物组织、线粒体、叶绿体，以及微生从生物材料（如动物组织、线粒体、叶绿体，以及微生物中的真菌、细菌和病毒等）中分离出的物中的真菌、细菌和病毒等）中分离出的dna或或rna，往往，往往是以是以dna- pro（dnp）或）或rna- pro（rnp）复合物的形）复合物的形式存在的，所以制备核酸样品时，首先需使复合物解聚，释式存在的，所以制备核酸样品时，首先需使复合物解聚，释放出核酸，除去放出核酸，除去pro，然后用沉淀法得到核酸，然后用沉淀法得到核酸（一）（一）dnp/rnpdnp/rnp复合物的解聚复合物的解聚在破细胞溶液中，加入适量的阴离子去

29、污剂在破细胞溶液中，加入适量的阴离子去污剂sds或十二烷或十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠doc、聚氧乙基十六烷基酚醚、聚氧乙基十六烷基酚醚、tween等，使等，使dnp/rnp解聚释放出核酸解聚释放出核酸加入适量醋酸钾溶液沉淀加入适量醋酸钾溶液沉淀sds-pro和和sds-k+等，然后离心等，然后离心除去沉淀除去沉淀分离上清，即为初步纯化的核酸制品分离上清，即为初步纯化的核酸制品1.加去污剂加去污剂2.加有机溶剂加有机溶剂 用有机溶剂反复处理抽提液，直至处理液经离心后，用有机溶剂反复处理抽提液，直至处理液经离心后，水相水相-有机相界面交接出无变性的有机相界面交接出无变性的p

30、ro为止为止 注意有机溶剂的祛除注意有机溶剂的祛除一般用乙醚提取，再在低一般用乙醚提取，再在低温蒸馏除净乙醚温蒸馏除净乙醚3.蛋白酶处理蛋白酶处理 用蛋白水解酶除去复合物中的用蛋白水解酶除去复合物中的pro组分，此法条件温组分，此法条件温和，一般不会造成对核酸的破坏和，一般不会造成对核酸的破坏 常用的常用的pro水解酶有：溶菌酶、蛋白酶水解酶有：溶菌酶、蛋白酶k、蛋白酶、蛋白酶e等等（二）消除多糖等杂质（二）消除多糖等杂质1.多糖多糖 抽提前用抽提前用“饥饿法饥饿法”可减少生物材料中可减少生物材料中贮存多糖贮存多糖（如淀粉、糖原等）的含量（如淀粉、糖原等）的含量 混杂于核酸提取液中的多糖类杂质

31、，一般用异丙醇、混杂于核酸提取液中的多糖类杂质，一般用异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（十六烷基三甲基溴化铵（ctab，适用于酸性多糖）等，适用于酸性多糖）等选择性沉淀剂除去；此外，也可用等体积选择性沉淀剂除去；此外，也可用等体积2.5mol/l磷磷酸缓冲液和等体积乙二醇甲醚处理，经离心，多糖位于酸缓冲液和等体积乙二醇甲醚处理，经离心，多糖位于中部，核酸位于上层乙二醇甲醚中中部，核酸位于上层乙二醇甲醚中2.dna与与rna的分离的分离盐析法盐析法 dna：易溶于：易溶于12mol/lnacl溶液，难溶于溶液，难溶于0.14 mol/lnacl溶液溶液原理原理 rna：易溶于：易溶于0.14 mol

32、/lnacl溶液，难溶于溶液，难溶于12mol/lnacl溶液溶液例：从小牛胸腺提取例：从小牛胸腺提取dna：用：用0.14 mol/lnacl溶液反复洗涤、绞碎、离心；溶液反复洗涤、绞碎、离心；结果结果rna存在于溶液，存在于溶液，dna存在于沉淀中存在于沉淀中酶水解法酶水解法在提取在提取dna时，用时，用rnase水解水解rna， rnase中混有的中混有的dnase用用100热热 处理处理15min在提取在提取rna时，用时，用dnase水解水解dna， dnase中混有的中混有的rnase，在，在ca2+存在存在条件下，加蛋白酶条件下，加蛋白酶k作用或加碘乙酸钠处理，使作用或加碘乙酸钠处理，使rnase破坏破坏（三）核酸沉淀（三）核酸沉淀 在核酸溶液中加入某些有机溶剂或非离子型聚在核酸溶液中加入某些有机溶剂或非离子型聚合物试剂时，核酸会被有效地沉淀合物试剂时，核酸会被有效地沉淀1.1.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法乙醇乙醇盐溶液盐溶液操作：操作：在核酸溶液（在核酸溶液（0.1l/ml）中加入）中加入0.1mol/l nacl 和和2倍量体积（倍量体积（dna）或）或2.5倍体