第07章蛋白质的分离纯化

1、 chapter7 protein的分离、纯化和表征的分离、纯化和表征一、一、protein的酸碱性质的酸碱性质（一）（一）protein的两性解离的两性解离 1、主链上两个末端、主链上两个末端nh2和和cooh的解离的解离 2、侧链上基团的解离、侧链上基团的解离（二）（二）protein的等电点（的等电点（pi） 1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电荷为零时的溶液的荷为零时的溶液的ph值称为值称为pi(isoelectric point). 2、当、当ph值值 pi 时，蛋白质带负电荷时，蛋白质带负电荷 当当ph值值pi 时，

2、蛋白质带正电荷时，蛋白质带正电荷 当当ph值值=pi 时，蛋白质带净电荷为零时，蛋白质带净电荷为零 3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质电泳分离电泳分离正极移动正极移动负极移动负极移动不移动不移动电泳二、二、protein的高分子性质的高分子性质1、稳定性因素（、稳定性因素（299页）：页）：（1）胶体性质（）胶体性质（丁达尔现象、布郎运动）丁达尔现象、布郎运动）； （2）形）形 成水化膜；（成水化膜；（3）双电离层）双电离层2、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它 小分子物质分离，纯化

3、蛋白质。小分子物质分离，纯化蛋白质。3、沉降系数（、沉降系数（s）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单 位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数，它表示沉，它表示沉 降分子的大小特性降分子的大小特性 。 三、三、protein的变性与复性的变性与复性 1、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（denaturation)。其本质是。其本质是高级结构破坏、

4、一级结构不变。高级结构破坏、一级结构不变。 蛋白质的复性：消除理化因素的影响，生物活性恢复或部分恢复。蛋白质的复性：消除理化因素的影响，生物活性恢复或部分恢复。 加热凝固变性不可逆。加热凝固变性不可逆。 2、意义：生产和保存蛋白制品；消毒；提纯等应用。、意义：生产和保存蛋白制品；消毒；提纯等应用。四、四、protein的沉淀（的沉淀（precipitation) 沉淀蛋白质的方法有沉淀蛋白质的方法有（一）盐溶盐析：中式盐，如硫酸铵，（一）盐溶盐析：中式盐，如硫酸铵，（降低蛋白质与水的亲和力 ）；（二）有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（二）有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（破坏蛋白质胶粒上的

5、水化层 ）；（三）重金属盐沉淀法：（三）重金属盐沉淀法：产生重金属蛋白盐沉淀； （四）生物碱试剂和某些酸类沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等（四）生物碱试剂和某些酸类沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等（五）加热变性沉淀法（五）加热变性沉淀法五、五、protein的颜色反应的颜色反应 （一）茚三酮反应：在（一）茚三酮反应：在ph57的溶液中，与茚三酮共热可产生蓝紫色物的溶液中，与茚三酮共热可产生蓝紫色物质，用于蛋白质的定性和定量。质，用于蛋白质的定性和定量。 （二）双缩脲反应：与双缩脲试剂（即碱性铜溶液）反应生成紫红色络（二）双缩脲反应：与双缩脲试剂（即碱性铜溶液）反应生成紫红色络合物，只与两个以上肽键化合

6、物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或合物，只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或蛋白质水解程度的测定。蛋白质水解程度的测定。 （三）酚试剂反应：与酚试剂（磷钼酸（三）酚试剂反应：与酚试剂（磷钼酸磷钨酸化合物）作用生成蓝磷钨酸化合物）作用生成蓝色物质，再用比色法定性和定量，其灵敏度比双缩脲反应高色物质，再用比色法定性和定量，其灵敏度比双缩脲反应高100倍。倍。六、六、protein吸收光谱的特点吸收光谱的特点 phe、tyr、trp 具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰为具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰为280nm处，处，此外，蛋白质分子中的肽键可引起此外，蛋白质分子中的肽

7、键可引起200220nm的最大光吸收，可用于蛋的最大光吸收，可用于蛋白质的定性和定量。白质的定性和定量。七、七、protein分子的免疫学特性分子的免疫学特性 免疫球蛋白的结构和功能免疫球蛋白的结构和功能八、八、 proteinprotein的分离纯化及鉴定的分离纯化及鉴定（一）（一）protein的提取的提取（300页）页） 1、选材：、选材： 2、破碎：、破碎：常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等机械破碎法。 3、提取：、提取：（二）（二）protein的分离纯化的分离纯化 1、盐析法：、盐析法：中性盐分级沉淀法，常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时

8、所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。 2、等电点沉淀法：、等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点ph稳定的蛋白质。 3、有机溶剂沉淀法：、有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 4、凝胶过滤（、凝胶过滤（303页）（页）（凝胶层析凝胶层析）(gel filtration chromatography):又又叫分子筛层析，常用的凝胶有交联葡聚糖叫分子筛层析，常用的凝胶有交联葡聚糖(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶(bio-gel p)和琼脂糖凝胶和

9、琼脂糖凝胶(bio-gel a)等。常用于大分子物质的分离纯化，等。常用于大分子物质的分离纯化，以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。5、离子交换层析离子交换层析：6、密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度。、密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度。 此外，有透析法、超过滤法、萃取法、此外，有透析法、超过滤法、萃取法、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳和和等电聚焦电泳等电聚焦电泳、超速离心、亲和层析等。、超速离心、亲和层析等。the end蛋白质与蛋白质与氨基酸、氨基酸、多肽一多肽一样，能够发生两性解离样，能够发生两性解离（两性电解质

10、），也有等（两性电解质），也有等电点（电点（pipi）。）。阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷。（221页）l此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。内部是多孔的网状结构。lsephadexsephadex- -葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶g10-g200g10-g200lsepharosesepharose- -琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶2 2b,4b,6bb,4b,6blsephacrylsephacryl- -丙烯

11、酰胺葡聚糖凝胶丙烯酰胺葡聚糖凝胶s100,s200,s300,s400s100,s200,s300,s400sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 （sds学名为十二烷基磺酸钠）学名为十二烷基磺酸钠）sdssds（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基多肽链中的氨基酸残基按大约按大约1 1 2 2比例结合。比例结合。这样，每一个蛋白质分这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的子都因为结合了许多的sdssds而带有大量的负电而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有荷，

12、而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大且它们的电荷密度也大体相同，因此，体相同，因此，e e q q值接值接近一个常数。所以该法近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白量大小不同而分离蛋白质。质。等电聚焦电泳：两性电解质载体由多烯多胺与丙烯酸加合得等电聚焦电泳：两性电解质载体由多烯多胺与丙烯酸加合得到，在电场作用下能形成连续的梯度。到，在电场作用下能形成连续的梯度。电电 泳泳 在等电点时蛋白质比较稳在等电点时蛋白质比较稳定，其物理性质如定，其物理性质如导电性、溶导电性、溶解度、粘度、渗透压解度、粘度、渗透压等皆最小。等皆最小。因此可利用蛋白质在等电点时因此可利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性来制备或沉溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。淀蛋