临床检验进及遗传病检测

1、临床检验进展及遗传病检测临床检验进展及遗传病检测 医学检验学院医学检验学院 20102010、5 5o1.血液一般检查血液一般检查o2.尿液一般检查尿液一般检查o3.粪便检查粪便检查o4.体液与分泌物检查体液与分泌物检查o5.骨髓检查及常用染色技术骨髓检查及常用染色技术o6.溶血检查溶血检查o7.出凝血检查出凝血检查o8.血液流变学检查血液流变学检查 检验这些项目检验这些项目的方法主要采用的方法主要采用一些化学方法、一些化学方法、免疫学方法等。免疫学方法等。近年来，许多分近年来，许多分子生物学方法也子生物学方法也开始应用于临床，开始应用于临床，对疾病的基因进对疾病的基因进行检测。行检测。 血液

2、学检验血液学检验的临床意义 人体在某些生理情况下或发生疾病时人体在某些生理情况下或发生疾病时, ,常常可引起血液细胞成分发生数量和质量的变化。可引起血液细胞成分发生数量和质量的变化。通过对血液中通过对血液中rbcrbc、wbcwbc、pltplt数量和形态改数量和形态改变的检验变的检验, ,常有助于确定某些疾病的诊断常有助于确定某些疾病的诊断, ,或或可作为辅助诊断。故血液常规检验在临床上可作为辅助诊断。故血液常规检验在临床上重要的临床意义。特别是对疾病鉴别诊断提重要的临床意义。特别是对疾病鉴别诊断提供重要临床依据。供重要临床依据。o血细胞分析仪的发展血细胞分析仪的发展n20世纪世纪50年代美

3、国库尔特首先发明了电阻式血细年代美国库尔特首先发明了电阻式血细胞分析仪胞分析仪n20世纪世纪80年代年代coulter公司又利用电阻、激光、公司又利用电阻、激光、高能电磁波等几项技术共同检测、综合分析，使血高能电磁波等几项技术共同检测、综合分析，使血细胞分析个更加准确细胞分析个更加准确n20世纪世纪90年代初从细胞膜的结构差异进行分析年代初从细胞膜的结构差异进行分析n目前，半自动血细胞分析仪在发达国家已经被淘汰，目前，半自动血细胞分析仪在发达国家已经被淘汰，取而代之的是全自动分析仪取而代之的是全自动分析仪血细胞计数主要是采用血细胞分析仪，血细胞计数主要是采用血细胞分析仪，其主要原理：根据血细胞

4、非传导的性其主要原理：根据血细胞非传导的性质，在浸入电解质的微孔管内外各有质，在浸入电解质的微孔管内外各有一电极，两电极形成一电极，两电极形成 电流，细胞经过电流，细胞经过微孔的瞬间以引起电阻的变化为基础，微孔的瞬间以引起电阻的变化为基础，进行血细胞计数和体积测定。进行血细胞计数和体积测定。a.正常红细胞形态 b 口形红细胞 血液检验与疾病鉴别o非血液系统疾病非血液系统疾病呼吸、消化、呼吸、消化、类白血病反应、妇科类白血病反应、妇科o血液系统疾病血液系统疾病血友病、骨髓瘤等血友病、骨髓瘤等血液学检验的进展 随着医学科学技术的发展和各学科的相随着医学科学技术的发展和各学科的相互渗透，当代的临床血

5、液学检验已发生根本性互渗透，当代的临床血液学检验已发生根本性变化。在检验科室内，它已经是一个业务内容变化。在检验科室内，它已经是一个业务内容广泛、拥有大量自动化精密仪器、由许多具备广泛、拥有大量自动化精密仪器、由许多具备血液学基础及临床知识和娴熟技术的人员组成血液学基础及临床知识和娴熟技术的人员组成的临床专业科室。的临床专业科室。其业务内容已扩展到包括血其业务内容已扩展到包括血细胞计数与形态学分析、红细胞病理相关分析、细胞计数与形态学分析、红细胞病理相关分析、白细胞病理相关分析以及血栓与止血相关分析白细胞病理相关分析以及血栓与止血相关分析等方面。等方面。 血细胞计数及形态学血细胞计数及形态学

6、应用最新一代的血液分析仪，除全血细胞计应用最新一代的血液分析仪，除全血细胞计数数(cbc) (cbc) 项目和白细胞分类计数以外：项目和白细胞分类计数以外：1.1.还可直接计数网织红细胞，包括网织红细胞血还可直接计数网织红细胞，包括网织红细胞血红蛋白含量（红蛋白含量（ chr chr ）和表示网织红细胞成熟程）和表示网织红细胞成熟程度的多项指标。度的多项指标。2.2.直接检测有核红细胞数，并可从白细胞总数中直接检测有核红细胞数，并可从白细胞总数中自动扣除有核红细胞，以及准确计数血小板总数自动扣除有核红细胞，以及准确计数血小板总数和计数大型血小板数等数十个参数。和计数大型血小板数等数十个参数。3

7、.3.测定红细胞比积（测定红细胞比积（ hct hct ）以及计算平均红细胞）以及计算平均红细胞体积体积 （mcvmcv） 、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白含量 （mchmch）和平均红细胞血红蛋白浓度（）和平均红细胞血红蛋白浓度（mchcmchc）。）。红细胞病理红细胞病理 分子生物学方法（如分子生物学方法（如 pcr pcr 、核酸、核酸分子杂交，基因或蛋白质芯片技术等）分子杂交，基因或蛋白质芯片技术等）取代生化方法检测与遗传有关的溶血取代生化方法检测与遗传有关的溶血性贫血和高铁血红蛋白血症患者红细性贫血和高铁血红蛋白血症患者红细胞内各种酶的测定、异常血红蛋白分胞内各种酶的测定

8、、异常血红蛋白分析和红细胞膜骨架蛋白等。析和红细胞膜骨架蛋白等。 白细胞病理白细胞病理 o存在的问题：存在的问题：o血液分析仪还不能准确辨认各类幼稚细胞、原始细血液分析仪还不能准确辨认各类幼稚细胞、原始细胞以及诸如中性粒细胞的胞以及诸如中性粒细胞的“毒性毒性”变化和变化和“不典型不典型淋巴细胞淋巴细胞”等，必要时还必须在显微镜下进行识别等，必要时还必须在显微镜下进行识别。o外周血淋巴细胞，实际上是由外周血淋巴细胞，实际上是由 t t 细胞、细胞、b b 细胞和自细胞和自然杀伤（然杀伤（ nk nk ）细胞所构成，其中）细胞所构成，其中 t t 细胞还可再分细胞还可再分成许多亚群。这些细胞在显微

9、镜下也无法区分。成许多亚群。这些细胞在显微镜下也无法区分。 白细胞病理白细胞病理o解决方案：解决方案：o采用特异的抗淋巴细胞分化抗原群（采用特异的抗淋巴细胞分化抗原群（ cd cd ）单）单克隆抗体，建立免疫方法（如流式细胞术）进克隆抗体，建立免疫方法（如流式细胞术）进行免疫表型检测。行免疫表型检测。o细胞遗传学（细胞遗传学（ cytogenetics, cytogenetics, 即染色体分析），即染色体分析），形成了所谓形成了所谓“mic”mic”鉴别模式。随着分子生物学鉴别模式。随着分子生物学技术的发展，又加入技术的发展，又加入 micm micm 模式。目前公认的模式。目前公认的白血病

10、分型标准是形态学白血病分型标准是形态学- -免疫学免疫学- -细胞遗传学细胞遗传学- -分子生物学即分子生物学即micmmicm分型。分型。 粪便检验粪便检验o粪便检验及进展粪便检验及进展n常规方法常规方法o目视检查目视检查o显微镜检查显微镜检查o粪便的化学检查粪便的化学检查o粪便的致病菌检查粪便的致病菌检查o其他粪便检验其他粪便检验o粪便隐血实验的进展n隐血实验是指检查胃肠道隐性出血的一类实验方法。隐血实验是指检查胃肠道隐性出血的一类实验方法。n传统的隐血实验是利用血液中红细胞的血红蛋白的传统的隐血实验是利用血液中红细胞的血红蛋白的亚铁血红素具有类过氧化物酶作用，能分解亚铁血红素具有类过氧化

11、物酶作用，能分解h2o2为水和活性氧而设计的简易化学实验。这类方法虽为水和活性氧而设计的简易化学实验。这类方法虽然成本低廉、简单易行，但特异性差、灵敏度较低，然成本低廉、简单易行，但特异性差、灵敏度较低，易受食物及服用药物成分的影响。为解决传统隐血易受食物及服用药物成分的影响。为解决传统隐血实验的特异性问题，探索出了一些新的实验方法，实验的特异性问题，探索出了一些新的实验方法，如放射性核素铬（如放射性核素铬（51cr）法等放射性核素法和免疫）法等放射性核素法和免疫学方法。学方法。o放射性核素方法放射性核素方法n铬（铬（51cr）法测定粪便隐血量：）法测定粪便隐血量：51cr-红细红细胞经静脉注

12、射后，正常不进入消化道，消化胞经静脉注射后，正常不进入消化道，消化道出血时则进入并不被吸收，随大便排出。道出血时则进入并不被吸收，随大便排出。将粪便中的放射性与每毫升血液中放射性比将粪便中的放射性与每毫升血液中放射性比较计算可求出胃肠道出血量。较计算可求出胃肠道出血量。o免疫学方法：是当前发展最快也最有临床实免疫学方法：是当前发展最快也最有临床实用价值的隐血实验方法。具有很好的灵敏度，用价值的隐血实验方法。具有很好的灵敏度，很高的特异性。很高的特异性。o免疫学方法免疫学方法n用于粪便隐血实验的抗体主要有三类：用于粪便隐血实验的抗体主要有三类：一种为抗人血红蛋白抗体，一种抗人红一种为抗人血红蛋白

13、抗体，一种抗人红细胞基质抗体，另一种为抗血液中其他细胞基质抗体，另一种为抗血液中其他成分如成分如tf、hb-hp等。等。n抗人血红蛋白法或抗人红细胞基质的抗人血红蛋白法或抗人红细胞基质的隐血试验是目前被认为对大肠癌普查最隐血试验是目前被认为对大肠癌普查最适用的试验。适用的试验。o近年来，大肠癌发病率有上升趋势，而大近年来，大肠癌发病率有上升趋势，而大肠癌的症状体征均无特异性，致使临床上肠癌的症状体征均无特异性，致使临床上确诊的大肠癌大部分为中、晚期，临床治确诊的大肠癌大部分为中、晚期，临床治疗效果差。五年生存率极低。如能早期诊疗效果差。五年生存率极低。如能早期诊断出大肠癌，可使断出大肠癌，可使

14、90%以上的患者得到以上的患者得到治愈。治愈。o大肠癌的诊断方法：大便隐血实验、纤维大肠癌的诊断方法：大便隐血实验、纤维结肠镜检查、肿瘤标记物检查和基因检测。结肠镜检查、肿瘤标记物检查和基因检测。o大便隐血实验是大肠癌的筛选检查大便隐血实验是大肠癌的筛选检查o纤维结肠镜检查是检出大肠癌的可靠方法纤维结肠镜检查是检出大肠癌的可靠方法o肿瘤标记物检查，虽然对大肠癌的临床诊肿瘤标记物检查，虽然对大肠癌的临床诊断及预后判断有帮助，但对早期大肠癌诊断及预后判断有帮助，但对早期大肠癌诊断的特异性及敏感性均不高。断的特异性及敏感性均不高。o随着分子生物学的发展，粪便中基因检测随着分子生物学的发展，粪便中基因

15、检测可望成为筛选诊断大肠癌的新方法。（脱可望成为筛选诊断大肠癌的新方法。（脱落细胞）落细胞）o分子生物学研究表明，肿瘤的产生是多能干细分子生物学研究表明，肿瘤的产生是多能干细胞像正常细胞增殖、分化的过程中，受环境因素胞像正常细胞增殖、分化的过程中，受环境因素和遗传因素的影响，相关基因改变的结果。肿瘤和遗传因素的影响，相关基因改变的结果。肿瘤细胞的基因与基因表达与正常细胞有显著区别，细胞的基因与基因表达与正常细胞有显著区别，因此如能检出这种基因改变就能为肿瘤的诊断和因此如能检出这种基因改变就能为肿瘤的诊断和预防提供条件。预防提供条件。o与大肠癌相关的癌基因有与大肠癌相关的癌基因有ras、c-my

16、c、-erb2等，与大肠癌相关的抑癌基因主要有等，与大肠癌相关的抑癌基因主要有apc/mcc、dcc、p53及及rb等。等。o免疫组织化学检测免疫组织化学检测osouthern印迹杂交印迹杂交odna直接测序直接测序opcr产物单链产物单链dna泳动变位技术和错配泳动变位技术和错配pcro基因芯片技术是一种高度集成的基因探针杂交基因芯片技术是一种高度集成的基因探针杂交技术。它既承袭了技术。它既承袭了dna探针杂交技术的高特异探针杂交技术的高特异性，又具备了同时检测多靶基因的实验高通量的性，又具备了同时检测多靶基因的实验高通量的特点。虽然有很好的优越性，目前还没有应用到特点。虽然有很好的优越性，

17、目前还没有应用到临床粪便检验。临床粪便检验。o色质谱分析是利用混合物中各组分的质量与所色质谱分析是利用混合物中各组分的质量与所带电荷的比值不同而实现组分分离的分离技术。带电荷的比值不同而实现组分分离的分离技术。目前还没有利用色质谱法大量读取粪便医用信息目前还没有利用色质谱法大量读取粪便医用信息的报道，但国内的许多学者以及开始了利用色谱的报道，但国内的许多学者以及开始了利用色谱法和质谱法进行粪便药动学研究、粪便毒物代谢法和质谱法进行粪便药动学研究、粪便毒物代谢研究甚至疾病的诊断探索。研究甚至疾病的诊断探索。 遗传病检测遗传病临床基因诊断的意义o在我国，出生缺陷调查提示各种先天性在我国，出生缺陷调

18、查提示各种先天性缺陷与遗传病约占缺陷与遗传病约占13%。由于对这些疾。由于对这些疾病基本上没有特异性治疗手段，因此预病基本上没有特异性治疗手段，因此预防患者出生成为现阶段对付这些疾病的防患者出生成为现阶段对付这些疾病的主要方法，尤其在我国，对遗传病高危主要方法，尤其在我国，对遗传病高危群体进行孕期产前基因诊断，对于提高群体进行孕期产前基因诊断，对于提高人口素质，落实优生的基本国策具有重人口素质，落实优生的基本国策具有重要的现实意义。要的现实意义。o携带者的检出最为重要。携带者的检出最为重要。遗传病临床基因诊断的分类 1.临症诊断：直接对特定遗传病患者的致病基因进行检测，临症诊断：直接对特定遗传

19、病患者的致病基因进行检测，判断被检基因是否存在异常。如地中海贫血患者的基因诊判断被检基因是否存在异常。如地中海贫血患者的基因诊断。断。2.症状前诊断：由于并不是所有的遗传病患者出生时即有相症状前诊断：由于并不是所有的遗传病患者出生时即有相关临床表现，这是针对某些迟发性遗传病家系高危个体进关临床表现，这是针对某些迟发性遗传病家系高危个体进行的一种基因诊断。这在动态突变类遗传病中应用最广泛，行的一种基因诊断。这在动态突变类遗传病中应用最广泛，如遗传性小脑脊髓性共济失调。如遗传性小脑脊髓性共济失调。3.产前诊断：是预防遗传病患儿出生最有效的方法。由于大产前诊断：是预防遗传病患儿出生最有效的方法。由于

20、大多数遗传病在出生前均无特异性的临床表现，生化检查又多数遗传病在出生前均无特异性的临床表现，生化检查又难以进行，因此通过获得胎儿细胞中的遗传物质进行产前难以进行，因此通过获得胎儿细胞中的遗传物质进行产前基因诊断是目前唯一可行的办法。如进行性肌营养不良症。基因诊断是目前唯一可行的办法。如进行性肌营养不良症。o传统的疾病诊断曾历经过三个阶段：传统的疾病诊断曾历经过三个阶段：一是临床学诊断，二是血清学诊断，一是临床学诊断，二是血清学诊断，三是生物化学诊断。而这些诊断都是三是生物化学诊断。而这些诊断都是以疾病的表型改变为依据的。以疾病的表型改变为依据的。o随着分子生物学技术的发展及其在疾随着分子生物学

21、技术的发展及其在疾病研究中的广泛应用，特别是在遗传病研究中的广泛应用，特别是在遗传病的研究中的应用，又兴起了第四代病的研究中的应用，又兴起了第四代诊断技术诊断技术基因诊断技术。基因诊断技术。o遗传病是指遗传物质发生突变遗传病是指遗传物质发生突变所引起的疾病。可分为三大类：所引起的疾病。可分为三大类：a) 单基因病单基因病b) 多基因病多基因病c) 染色体病染色体病 基因诊断是以基因诊断是以dna 和和rna为诊断材料，应用分子生物学为诊断材料，应用分子生物学技术，通过检查基因的结构及技术，通过检查基因的结构及其表达功能来诊断疾病的方法其表达功能来诊断疾病的方法和过程。和过程。1.片段性突变片段

22、性突变（大片段缺（大片段缺失、插入或倒位）失、插入或倒位）a) 染色体片段如染色体病染色体片段如染色体病b) 整个基因整个基因c) 数个外显子数个外显子d) 倒位倒位2.点突变点突变a) 单核苷酸取代单核苷酸取代b) 少数核苷酸缺失或插入少数核苷酸缺失或插入3.动态突变动态突变多态性三核苷酸重多态性三核苷酸重复序列的扩增复序列的扩增o如果某种遗传病是由于基因缺失造成的，可如果某种遗传病是由于基因缺失造成的，可通过检测受检者是否缺失该基因来直接判断通过检测受检者是否缺失该基因来直接判断其基因型。如果致病突变或病因还不清楚，其基因型。如果致病突变或病因还不清楚，但有与其紧密连锁的多态性位点，通过该

23、位但有与其紧密连锁的多态性位点，通过该位点状态的连锁分析进行检测。不同类型的突点状态的连锁分析进行检测。不同类型的突变有不同的诊断途径：变有不同的诊断途径：1.突变已知时用突变已知时用直接检测法直接检测法突变检测突变检测2.突变未知或突变已知但突变类型较多时用突变未知或突变已知但突变类型较多时用间间接诊断法接诊断法多态性连锁分析多态性连锁分析一、直接检测法一、直接检测法 是指直接检测基因的致病突变，是指直接检测基因的致病突变，因此其前提是被检致病基因的正常因此其前提是被检致病基因的正常序列和结构已被阐明。序列和结构已被阐明。二、多态性连锁分析二、多态性连锁分析 连锁是指同一条染色体上和致连锁是

24、指同一条染色体上和致病基因相邻近的基因一起被遗传，病基因相邻近的基因一起被遗传，可以作为遗传标记，这样只要鉴定可以作为遗传标记，这样只要鉴定标记的存在，就可以判断受检者是标记的存在，就可以判断受检者是否带有致病基因否带有致病基因。o典型的连锁分析包括以下程序：典型的连锁分析包括以下程序： 确定分析方法确定分析方法 首选首选pcr方法，检测方法，检测rflp和缺失的和缺失的southern印迹方法已印迹方法已被被pcr产物的酶切法或多重产物的酶切法或多重pcr取代。取代。 选择合适的多态性标记位点选择合适的多态性标记位点 多态性分析多态性分析 多家系核心成员（父母及多家系核心成员（父母及先症者）

25、及待测个体进行多态性分析，先症者）及待测个体进行多态性分析，确定标记位点的基因型确定标记位点的基因型 分析、判断并解释得到的结果分析、判断并解释得到的结果选择合适的多态性标记位点o一个好的标记位点应具有以下特性：一个好的标记位点应具有以下特性： 分析方法必须简单可行，取材方便分析方法必须简单可行，取材方便 结果容易判读，四核苷酸重复序列多态结果容易判读，四核苷酸重复序列多态性比二核苷酸重复序列多态性好性比二核苷酸重复序列多态性好 等位基因数码要多，有较高的多态性信等位基因数码要多，有较高的多态性信息量，是被测个体在该位点有较高的机息量，是被测个体在该位点有较高的机会为杂合子会为杂合子 与疾病基

26、因连锁紧密程度越高越好，连与疾病基因连锁紧密程度越高越好，连锁越紧密发生重组的可能性越低，结果锁越紧密发生重组的可能性越低，结果的可靠性越高。的可靠性越高。o首先根据孟德尔定律遗传模式，首先根据孟德尔定律遗传模式，通过核心家系成员的多态性资料，通过核心家系成员的多态性资料，确定父源或母源等位基因的标记，确定父源或母源等位基因的标记，即确定致病基因与标记点等位片即确定致病基因与标记点等位片段的连锁相，然后根据待测个体段的连锁相，然后根据待测个体获得的父源或及母源标记等位基获得的父源或及母源标记等位基因确定其是否携带致病基因。因确定其是否携带致病基因。1.家系中的关键成员（父母）为标记位点杂合家系中的关键成员（父母）为标记位点杂合子，这样才能区分两天同源染色体。子，这样才能区分两天同源染色体。2.子代中存在患病的纯合子，这样才能确定致子代中存在患病的纯合子，这样才能确定致病基因与哪条染色体的标记位点共同遗传病基因与哪条染色体的标记位点共同遗传3.任何一种遗传病，单独使用一种多态性位点，任何一种遗传病，单独使用一种多态性位点，均有相当一部分