形态学研究及其方法进展PPT课件

1、形态学研究及其形态学研究及其 方方 法法 进进 展展宋天保2006年10月形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法免疫组化方法进展免疫组化方法进展基于基于PCR的原位检测技术的原位检测技术1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法1.1 1.1 形态学发展简史形态学发展简史解剖学的发展解剖学的发展Galen(130 - 200) 论解剖过程论解剖过程, ,论身论身体各部器官的功能体各部器官的功能Vesalius(1514 - 1564) 人体的构造人体的构造(1543)(1543)光学显微镜的发明光学显微镜的发明Leeuwenhoek(1632-1723)Leeuwenhoek(16

2、32-1723)Hooke(1635-1702)Hooke(1635-1702)显微图谱显微图谱（16651665）1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法细胞学说的建立和完善细胞学说的建立和完善Schleiden(1804-1881)Schleiden(1804-1881)“植物发生论植物发生论”（1838）Schwann(1810-1882)Schwann(1810-1882)“关于动植物的结构和生长一致关于动植物的结构和生长一致性的显微研究性的显微研究” (1839) Virchow(1821-1902)Virchow(1821-1902)细胞病理学细胞病理学(1858) “

3、omnis cellula e cellula” 1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法电子显微镜的发明和超微结构研究电子显微镜的发明和超微结构研究KnollKnoll和和Ruska(1932)Ruska(1932)Nobelprize19861. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法现代形态学的发展现代形态学的发展细胞细胞( (组织组织) )化学化学, ,免疫细胞化免疫细胞化学学, ,原位分子杂交原位分子杂交, ,细胞培养等细胞培养等向定量化、自动化和数字化向定量化、自动化和数字化发展发展1. 1. 形态学研究思路和

4、方法形态学研究思路和方法1.2 1.2 形态学的作用和地位形态学的作用和地位(1)(1)探索生命活动的结构基础探索生命活动的结构基础(2)(2)为某些学说的建立提供形态基础为某些学说的建立提供形态基础 如如: :神经元学说神经元学说, ,肌丝滑动学说肌丝滑动学说(3)(3)在生命科学研究中的地位逐渐上升在生命科学研究中的地位逐渐上升(4)(4)与机能学研究相辅相成与机能学研究相辅相成Nobelprize 19061. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法1.3 1.3 形态学研究的思路形态学研究的思路(1) (1) 水平：水平： 大体观测大体观测( (器官器官) )立体显微镜立体显微

5、镜( (组织组织)-)-光镜光镜( (细细 胞胞) )电镜电镜( (亚细胞亚细胞)-)-扫描探针显微镜扫描探针显微镜( (分子和原分子和原 子子) )(2)(2)对象：对象：活体活体离体培养离体培养 固定组织固定组织(3)(3)方法方法: :1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法选用形态学方法时的基本思考：选用形态学方法时的基本思考：研究目的研究目的有无必要有无必要选用何种方法选用何种方法有无条件有无条件高质量照片高质量照片结合其他资料分析结合其他资料分析注意人工假象注意人工假象( (预成论预成论, ,凤凤汉小体汉小体) )1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法1.

6、4 1.4 形态学研究的方法形态学研究的方法(1)(1)普通光镜术：普通光镜术：常规方法常规方法: :固定固定切片切片-染色染色(H-E)(H-E)特殊染色特殊染色: :1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法(2)(2)特殊光镜术：特殊光镜术： 荧光显微镜荧光显微镜相差显微镜相差显微镜1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法暗视野显微镜暗视野显微镜 激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜 1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法(3)(3)电镜术：电镜术： 透射电镜术透射电镜术 扫描电镜术扫描电镜术 冷冻蚀刻术冷冻蚀刻术 1. 1. 形态学研究思路和方法

7、形态学研究思路和方法(4)(4)组织组织( (细胞细胞) )化学术：化学术：糖糖, ,脂类脂类. .蛋白蛋白, ,核酸核酸, ,酶等酶等 1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法(5)(5)放射自显影术：放射自显影术： 1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法(6)(6)免疫组织免疫组织( (细胞细胞) )化学术：化学术： PAP,ABC,SPPAP,ABC,SP1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法(7)(7)原位杂交：原位杂交：探针探针:DNA,RNA,ODN:DNA,RNA,ODN标记物标记物: : 放射性核素放射性核素 非放射性非放射性显示显示:

8、:放射自显影放射自显影 免疫组化免疫组化 荧光荧光 1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法(8) (8) 细胞培养术：细胞培养术： 1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法(9) (9) 活体与活细胞染色：活体与活细胞染色： 1. 1. 形态学研究思路和方法形态学研究思路和方法(10) (10) 形态研究的定量术：形态研究的定量术： 形态计量术形态计量术( (体视学体视学) ) 显微分光光度术显微分光光度术 图像分析术图像分析术 流式细胞术流式细胞术2. 2. 免疫组化方法进展免疫组化方法进展2.1 EPOS2.1 EPOS法法(enhanced polymer on

9、e step method)(enhanced polymer one step method)原理：原理：酶酶(HRP)(HRP)+ +惰性聚合物惰性聚合物( (葡聚糖葡聚糖) )酶标聚合物酶标聚合物 + AB1 + AB1 酶酶- -聚合物聚合物-AB1-AB1方法：方法：酶酶- -聚合物聚合物-AB1-AB1显色。显色。变法：变法：( (rapid microwave rapid microwave one step method, one step method,RAMOSRAMOS) ) 加酶加酶- -聚合物聚合物-AB1-AB1盖玻片盖玻片 微波炉微波炉显色显色2. 2. 免疫组化

10、方法进展免疫组化方法进展特点：特点：只有只有1 1步，特异性强；步，特异性强； 敏感性高敏感性高（70 mole70 mole酶酶/1 mole/1 mole聚合物）聚合物）； 简便、快速简便、快速; ; 适用于石蜡、冰冻切片，细胞涂适用于石蜡、冰冻切片，细胞涂 片等。片等。 RAMOSRAMOS法还有：法还有： 试剂用量少，成本低；试剂用量少，成本低； 无脱片现象；无脱片现象； 无边缘现象，染色均匀。无边缘现象，染色均匀。 2. 2. 免疫组化方法进展免疫组化方法进展2.2 EnVision2.2 EnVision法法原理：原理：酶酶(HRP)(HRP)+ +惰性聚合物惰性聚合物( (葡聚糖

11、葡聚糖) )酶标聚合物酶标聚合物 + AB2 + AB2 AB2- AB2-聚合物聚合物- -酶酶( (含含100100个酶、个酶、1515个个Ab2Ab2分子分子) )方法：方法：AB1AB1 AB2- AB2-聚合物聚合物- -酶酶显色显色2. 2. 免疫组化方法进展免疫组化方法进展特点：特点： 敏感性高敏感性高; ; 背景低背景低（体内无葡聚糖）（体内无葡聚糖）; ; 孵育时间短孵育时间短（37, 1537, 15 min min）, ,适用于术中适用于术中 病理诊断病理诊断; ; Ab1 Ab1最好用单抗，浓最好用单抗，浓 度可大一点度可大一点2. 2. 免疫组化方法进展免疫组化方法进

12、展2. 2. 免疫组化方法进展免疫组化方法进展2.3 CSA2.3 CSA法法(catalyzed signal amplification)(catalyzed signal amplification)原理：原理：基本方法为基本方法为SPSP法法 加用生物素标记酪胺加用生物素标记酪胺 HRPHRP催化酪胺使之沉积在催化酪胺使之沉积在Ag-AbAg-Ab结合位点结合位点2. 2. 免疫组化方法进展免疫组化方法进展方法：方法： AB1 AB1 AB2-Bio AB2-Bio SA-HRP SA-HRP 酪胺酪胺-Bio -Bio SA-HRP SA-HRP 显色显色 优点：优点：敏感性高敏感性

13、高; Ab1; Ab1稀释度高，背景染色低稀释度高，背景染色低; ; 省时省时; ; 适用于信号弱的组织适用于信号弱的组织（戊二醛固定）（戊二醛固定）; ; 第第2 2次用的次用的SASA亦可用荧光素、胶体金、亦可用荧光素、胶体金、AKPAKP标记标记; ; 也可用于放大原位杂交信号也可用于放大原位杂交信号. . 3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR3.1 3.1 原位原位PCRPCR 定义：定义：将将PCRPCR的高效扩增与的高效扩增与ISHISH的细胞定位相结合，在的细胞定位相结合，在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定组织细胞原位检测单拷

14、贝或低拷贝的特定DNADNA或或RNARNA序序列，同时对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。列，同时对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。分类：分类：原位原位PCRPCR：以：以DNADNA为起始模板为起始模板PCRPCR扩增扩增检测扩增产检测扩增产物。又分直接法和间接法物。又分直接法和间接法原位反转录原位反转录PCRPCR：以：以mRNAmRNA为起始物为起始物反转录成反转录成cDNAcDNA以以cDANcDAN为模板行为模板行PCRPCR扩增扩增检测扩增产物。检测扩增产物。原位再生式序列复制反应：以原位再生式序列复制反应：以mRNAmRNA为模板直接扩增为模板直接扩增RNARNA靶序列。靶序

15、列。3.2 3.2 直接法原位直接法原位PCRPCR 特点：特点：PCRPCR扩增时用标记扩增时用标记dNTPdNTP或引物或引物, ,使扩增产物直接使扩增产物直接 标记标记标记物：标记物：常用同位素、生物素、地高辛常用同位素、生物素、地高辛操作程序：操作程序：组织细胞制备：组织细胞制备：固定、预处理固定、预处理原位扩增：引物原位扩增：引物, TaqDNA聚合酶聚合酶,标记标记dNTP扩增产物检测：放扩增产物检测：放射自显影，射自显影，ICC3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR评价：评价： 优点：操作简便、流程短、省时优点：操作简便、流程短、省

16、时 缺点：特异性差，假阳性率高缺点：特异性差，假阳性率高（固定、包埋、制片等使（固定、包埋、制片等使 标本内标本内DNADNA受损，受损， DNADNA修复时，标记修复时，标记dNTPdNTP进入非靶进入非靶 序列；引物与模板的错配）序列；引物与模板的错配） 扩增效率低扩增效率低 不适用于切片标本不适用于切片标本（切片比细胞标本（切片比细胞标本DNADNA受损重）受损重）3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR3.3 3.3 间接法原位间接法原位PCRPCR 特点：特点：PCRPCR体系中体系中dNTPdNTP和引物均不标记和引物均不标记 PCRP

17、CR扩增结束后用标记探针行原位杂交扩增结束后用标记探针行原位杂交标记物：标记物：以生物素、地高辛较为常用以生物素、地高辛较为常用操作程序：操作程序：组织细胞制备：组织细胞制备：固定、预处理固定、预处理渗入和原位扩增：渗入和原位扩增：dNTP，引物，引物, Taq DNA聚合酶聚合酶扩增产物检测：扩增产物检测：ICC原位杂交：原位杂交： 用特异性标记用特异性标记探针探针3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR评价：评价：目前最常用目前最常用 优点：扩增效率高优点：扩增效率高 特异性强特异性强（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增（杂交探针特异性结合靶序

18、列，不与扩增 产物中的非靶序列结合）产物中的非靶序列结合） 可用于细胞制备和石蜡切片标本可用于细胞制备和石蜡切片标本 缺点：操作复杂缺点：操作复杂3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR举例：举例：石蜡切片，石蜡切片，DigDig标记标记标本制备：标本制备：10%福马林固定，石福马林固定，石蜡切片蜡切片5 m。预处理：预处理：脱蜡至水脱蜡至水;0.2mol/L HCl，10; 5 g/ml 蛋白酶蛋白酶K 37 10; RNase消化消化37 30; Alc脱水干燥。脱水干燥。原位扩增：原位扩增：PCR扩增反应液扩增反应液30 l，加盖片，加盖片封

19、边封边; PCR热循环：热循环：94 1，55 1， 72 1.5， 25-30个循环，个循环， 72延延伸伸 10； 去盖片，去盖片，4%4%多聚甲醛后固定多聚甲醛后固定1010； Alc脱水干燥。脱水干燥。原位杂交：原位杂交： Dig标记探针，标记探针，98 变性变性10，-20 退火退火5，42 杂交过夜；杂交过夜；洗涤：洗涤：2SSC 10 3，1SSC 10 3，缓冲液洗，缓冲液洗10 3；AKP-Dig-Ab，37 ，2h;BCIP/NBT显色；显色；脱水、透明、封固。脱水、透明、封固。3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR3.4 3

20、.4 原位原位RT-PCRRT-PCR 原理：原理： 逆转录酶逆转录酶 mRNAmRNA为模板为模板 cDNAcDNA Taq Taq聚合酶聚合酶 cDNAcDNA为模板为模板 扩增产物扩增产物 直接直接（直接法）（直接法）或原位杂交或原位杂交（间接法）（间接法）检测扩增产物检测扩增产物 注意：注意：标本先以标本先以DNase处理过夜，破坏处理过夜，破坏DNA反转录条件反转录条件42,30-6042,30-60反转录后加热反转录后加热9090以上灭活逆转录酶以上灭活逆转录酶3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR程序：程序：组织细胞制备：组织细胞制

21、备：10%10%福马林固福马林固定。定。预处理：预处理：DNaseDNase消化过夜；蛋消化过夜；蛋白酶白酶K K消化消化（54,2054,20）；95,395,3灭活蛋白酶灭活蛋白酶K K。逆转录反应：逆转录反应：反应液含逆转反应液含逆转录酶、引物、录酶、引物、dNTPsdNTPs，并有，并有RNaseRNase抑制剂抑制剂,42,30-,42,30-6060。 95109510灭活逆转录灭活逆转录酶。酶。PCRPCR扩增：扩增：加加TaqTaq聚合酶、聚合酶、引物、引物、dNTPsdNTPs扩增；扩增后扩增；扩增后烤烤80, 15-3080, 15-30。原位杂交：原位杂交：原位杂交后或原

22、位杂交后或直接用直接用ICCICC检测扩增产物。检测扩增产物。3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR3.5 3.5 原位再生式序列复制反应原位再生式序列复制反应( (原位原位3SR3SR反应反应) ) 原理：原理：直接进行直接进行RNARNA扩增，检测细胞内低拷贝扩增，检测细胞内低拷贝mRNAmRNA特点：特点：3 3种工具酶：种工具酶：AMVAMV逆转录酶、逆转录酶、RNaseRNase H H、T7RNAT7RNA聚合酶聚合酶 引物引物55端有端有T7RNAT7RNA聚合酶启动子聚合酶启动子 扩增反应扩增反应4242，2h2h，不需热循环，不

23、需热循环程序：程序：细胞固定、脱水干燥；细胞固定、脱水干燥； 制备制备55端含端含T7T7启动子的引物；启动子的引物； PCRPCR制备标记探针（制备标记探针（Dig-11-dUTPDig-11-dUTP）；）； 原位扩增（反应液含引物、原位扩增（反应液含引物、dNTPsdNTPs、3 3种酶等）；种酶等）； 原位杂交（加探针原位杂交（加探针9595变性变性1010， 4040杂交过夜，显色杂交过夜，显色 ）3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR3.6 3.6 原位原位PCRPCR的对照试验的对照试验 已知阳性、阴性对照试验已知阳性、阴性对照试验

24、 省去或用无关引物替代特异性引物省去或用无关引物替代特异性引物 标本用标本用DNaseDNase或或RNaseRNase预处理预处理 直接、间接原位直接、间接原位PCRPCR中省去中省去DNADNA聚合酶聚合酶 原位原位RT-PCRRT-PCR和原位和原位3SR3SR反应中省去逆转录酶反应中省去逆转录酶3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR3.7 3.7 原位原位PCRPCR的应用的应用 检测内源性基因检测内源性基因 固有基因定位固有基因定位-最敏感，低拷贝最敏感，低拷贝 异常及变异基因异常及变异基因-与遗传性疾病的研究与遗传性疾病的研究检测外源

25、性基因检测外源性基因 感染（病毒、细菌）基因感染（病毒、细菌）基因-诊断诊断 转基因，基因治疗转基因，基因治疗-基因定位、有无突变基因定位、有无突变3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR3.8 3.8 原位原位PCRPCR存在问题及对策存在问题及对策 敏感性：敏感性：在细胞制备高在细胞制备高( (单拷贝单拷贝) )；在切片标本低，扩增效率低；在切片标本低，扩增效率低特异性：特异性：间接法高，直接法低（假阳性）间接法高，直接法低（假阳性） 原位扩增时采用热启动原位扩增时采用热启动PCRPCR或套式或套式PCRPCR可提高特异性可提高特异性 引物延伸

26、时掺入引物延伸时掺入Bio-dNTPsBio-dNTPs合成的新链体积大合成的新链体积大不不 易扩散易扩散 用针对同一靶序列不同片段的多对引物扩增用针对同一靶序列不同片段的多对引物扩增多个不多个不 同长度扩增产物重叠交织同长度扩增产物重叠交织不易扩散，且敏感性提高不易扩散，且敏感性提高复杂性：复杂性：需规范操作，需对照试验，需简化操作需规范操作，需对照试验，需简化操作定量分析：定量分析：尚不成熟尚不成熟 3. 3. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位原位PCRPCR4.1 4.1 免疫免疫PCRPCR概述概述：利用细胞工程和基因工程技术，将利用细胞工程和基因工程技术，将

27、Ag-AbAg-Ab反反 应的特异性与应的特异性与PCRPCR的敏感性结合，用以检测的敏感性结合，用以检测AgAg分子。分子。原理：原理：用一用一中介分子中介分子同时结合同时结合DNADNA和和AbAb，AbAb与与AgAg特异性特异性 结合，结合，DNADNA用特异引物行用特异引物行PCRPCR扩增，通过显示扩增产扩增，通过显示扩增产 物对物对AgAg进行定性和定量。进行定性和定量。与与ELISAELISA比较：比较：本质为本质为ELISAELISA，但，但 作用于底物的酶被结合于作用于底物的酶被结合于AbAb的标记的标记DNADNA分子取代；分子取代； 酶标显色被酶标显色被PCRPCR扩增

28、取代。扩增取代。优点：优点：敏感性提高近敏感性提高近1 1万倍，可检测含量极低的万倍，可检测含量极低的AgAg。4. 4. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位免疫原位免疫PCRPCR4.2 4.2 中介分子的种类中介分子的种类 蛋白蛋白A(PA)A(PA)与链霉亲和素与链霉亲和素(SA)(SA)嵌合分子：嵌合分子： 利用基因工程表达的嵌合分子利用基因工程表达的嵌合分子 PAPA可结合可结合IgG FcIgG Fc段，段，SASA可结合生物素化可结合生物素化DNA;DNA; 假阳性假阳性: :PAPA可能与标本和血清中残留可能与标本和血清中残留IgIg结合结合 抗体只能是

29、抗体只能是IgGIgG分子分子(Ab(Ab-Bio)-SA-(Bio-DNA)-Bio)-SA-(Bio-DNA)： 将抗体和一段核苷酸分别生物素化，再以将抗体和一段核苷酸分别生物素化，再以SASA连接二者连接二者 抗体结合抗体结合AgAg，核酸用引物，核酸用引物PCRPCR扩增扩增单链抗体单链抗体-SA-SA融合蛋白：融合蛋白： 利用基因工程将利用基因工程将McAbMcAb的重链和轻链连接成单链，再与的重链和轻链连接成单链，再与SASA连接连接 单链抗体单链抗体-SA-SA4. 4. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位免疫原位免疫PCRPCR4.3 4.3 原位免疫原

30、位免疫PCRPCR原理：原理：将将PCRPCR与免疫组化结合，在组织细胞原位检测抗原与免疫组化结合，在组织细胞原位检测抗原: : 中介分子连接中介分子连接Ag-AbAg-Ab复合物和标记复合物和标记DNADNAAg-Ab-DNAAg-Ab-DNA复合物复合物 PCRPCR扩增扩增DNADNA检测扩增产物检测扩增产物间接证明间接证明AgAg存在存在4. 4. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位免疫原位免疫PCRPCR方法：方法：石蜡切片脱蜡至水；石蜡切片脱蜡至水；0.3%0.3%双氧水双氧水- -甲醇甲醇2020；3 mol/L3 mol/L尿素尿素3030；10%10%

31、小牛血清小牛血清3737 3030; ;Ab1 37Ab1 37 1-2h 1-2h; PBS; PBS洗洗; ;生物素化生物素化Ab2 Ab2 37371h; PBS1h; PBS洗洗; ;SA 1:100, 1h;SA 1:100, 1h;生物素化生物素化DNADNA（20ng/20ng/片）片）37371h; 1h; PBSPBS洗后行原位洗后行原位PCRPCR扩增扩增(25(25 l反应反应液加引物液加引物, dNTPs, Bio-dUTP, Taq酶等酶等) )；ABCABC法呈色，法呈色，复染、封片。复染、封片。4. 4. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位

32、免疫原位免疫PCRPCR增加敏感性：增加敏感性： 用放射性同位素、荧光素、酶标记物掺入用放射性同位素、荧光素、酶标记物掺入PCRPCR产物产物 改变改变AbAb和中介连接物浓度和中介连接物浓度 控制控制PCRPCR循环周期数、改进循环周期数、改进PCRPCR产物检测方法产物检测方法注意事项：注意事项： 防止非特异性：外源性防止非特异性：外源性DNADNA和引物应与被检材料固有及外来基和引物应与被检材料固有及外来基 因无互补序列因无互补序列 用尿素或微波替代蛋白酶消化：防止残存酶对用尿素或微波替代蛋白酶消化：防止残存酶对TaqTaq酶的降解酶的降解 充分洗涤：去除非特异结合充分洗涤：去除非特异结

33、合 设立阳性、阴性对照设立阳性、阴性对照4. 4. 基于基于PCRPCR的原位检测技术的原位检测技术- -原位免疫原位免疫PCRPCR5. 5. 引物介导的原位标记技术引物介导的原位标记技术5.15.1 原理原理(primed in situ labelling(primed in situ labelling, , PRINSPRINS) )寡核苷酸引物或变性寡核苷酸引物或变性DNADNA片段与标本上靶片段与标本上靶DNADNA互补复性互补复性在聚合酶作用下单次延伸（用标记在聚合酶作用下单次延伸（用标记dUTPdUTP），），新合成新合成DNADNA即带有标记物，检测。即带有标记物，检测。组织细胞制备：组织细胞制备：固定、预处理固定、预处理复性与延伸：引物复性与延伸：引物, dNTP(含标记含标记dUTP)，Taq DNA聚合酶聚合酶检测：荧光显检测：荧光显微镜或微镜或ICC5. 5. 引物介导的原位标记技术引物介导的原位标记技术5.25.2 方法方法5.2.15.2.1 染色体标本染色体标本 新鲜组织块胰酶消化成单细新鲜组织块胰酶消化成单细 胞，制备间期核或染色体胞，制备间期核或染色体; Alc脱水，空气干燥；脱水，空气干燥； 94加热，并加上加热，并加上50 l PCR 反应液反应液 (含引物含引物