广东省辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性

1、广东省辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性姜彦全,王振中*（华南农业大学植物病理生理学研究室,广州 510642）摘要 从广东省各地采集了54个辣椒疫霉菌株，分别测定了菌丝生长和游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性。结果表明，嘧菌酯对辣椒疫霉的菌丝生长具有很强的抑制作用，EC50范围为0.142 81.950 9 g/mL，平均为0.964 9g /mL；对游动孢子囊形成的抑制作用更强，EC50范围为0.001 00.084 4g /mL平均为0.023 9g /mL。正态分析表明，辣椒疫病菌54个菌株菌丝生长对嘧菌酯的敏感性符合正态分布，而孢子萌发则在高浓度区具有拖尾现象，表明自然界中已存在个别具有一定耐药

2、性的辣椒疫霉种群。 关键词 辣椒疫霉； 嘧菌酯； 抗药性中图分类号 S 482.2Sensitivity of Phytophthora capsici to azoxystrobin in GuangdongJiang Yanquan， Wang Zhenzhong(Laboratory of Physiological Plant Pathology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China）Abstract Fiftyfour isolates of the pathogen Phytophthora ca

3、psici of capsicum blight were collected from several capsicumplanting areas in Guangdong Province. Sensitivity experiments showed that mycelial growth of the pathogen was affected by azoxystrobin, with a mean EC50 as 0.964 9g /mL, ranging from 0.142 8g /mL to 1.950 9g /mL,and sporangial formation wa

4、s affected by the fungicide to a greater extent, with a mean EC50 as 0.023 9g /mL,ranging from 0.001 0g /mL to 0.084 4g /mL. Normal distribution analysis showed that the sensitivity of these isolates to azoxystrobin was fitted well with a normal distribution function, but that of sporangial formatio

5、n was not. The results suggested that, under natural conditions in Guangdong, there were some strains of capsicum blight pathogen that had resistance to the fungicide to some extent.Key wordsPhytophthora capsici;azoxystrobin; drugresistance辣椒疫病是由辣椒疫霉（Phytophthora capsici）引起的一种毁灭性土传病害。在世界各地的辣椒种植区普遍发生

6、，我国各辣椒产区疫病大量发生，严重影响了辣椒的产量和品质1。辣椒疫霉除了侵染辣椒以外，还可以侵染番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜等，病菌侵染后潜育期短，发病快，因而辣椒疫病防治十分困难。目前，防治辣椒疫病主要用化学防治方法，由于辣椒疫霉菌极易对杀菌剂产生抗药性，化学防治的效果常常因为病菌抗药性的提高而大大降低。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（strobilurins）是以天然产物strobilurin A为先导化合物开发而来的一类仿生合成杀菌剂，是继苯并咪唑类后的一类新颖杀菌剂。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是一种广谱杀菌剂，能有效地防治卵菌、接合菌、子囊菌、担子菌和半知菌等真菌引起的病害。1992年11月

7、第一个甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂新产品嘧菌酯（azoxystrobin）诞生，至2001年已在70个国家80多种作物上登记。嘧菌酯于2001年在我国登记，至今，strobilurins作为杀菌剂专利共有近30家公司，产品近500个2。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用于真菌线粒体电子传递链的复合物，阻断电子传递，干扰能量合成。由于其作用机制新颖，与苯基酰胺类杀菌剂无交互抗药性，目前被广泛使用。但已有研究表明某些病原菌靶标对该类药剂产生抗药性自发突变频率较高。目前甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂刚开始应用于辣椒疫霉菌的防治，分析研究其抗药性现状和抗药性产生的可能性，具有重要的实践意义。1材料与方法1.1 病原菌的分离

8、与纯化在无菌操作条件下，将辣椒感病组织，切成0.5 cm见方的小块，用75的乙醇对上述小块病组织表面消毒后，用已灭好菌的滤纸、保湿纸和硬纸依次由内到外包好，然后放在d=9 cm铺有滤纸和保湿纸的培养皿中，每皿放3块，在25下培养715 d，其中每隔3天观察1次并保持病组织块的湿润状态。选取白色霉状物的病组织块，再按照常规方法3用次氯酸钠溶液灭菌1min后，放于选择性培养基上进行培养。按郑小波的方法4，将盛有大量孢子囊的培养皿放入4冰箱中1015 min后，取出置于25下30 min，低倍镜下可见大量游动孢子释放，用灭菌吸管吸取孢子悬浮液14滴（视孢子浓度而定）涂布于含青霉素、利福平、五氯硝基苯

9、各50g /mL的10% V8汁水琼脂平板上，置25 黑暗培养812 h。取出培养皿置于显微镜下观察；切取带有单个已萌发游动孢子的琼脂块置于选择性培养基（含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50g /mL的LBA培养基（利马豆60g加水1 000 mL，充分煮沸，4层纱布过滤去渣，滤液补足水至1 000 mL，加入琼脂20g）平板上,在25 黑暗中培养23 d,可获得纯净的单游动孢子无性系。1.2 辣椒疫霉菌丝生长对嘧菌酯的敏感性测定本试验所用的嘧菌酯由先正达公司赠送，为98%原药。原药先用V（甲醇）V(丙酮)=13配制成浓度为100g /mL的母液备用。将疫霉菌接种于LBA培养基平板上，25 下黑

10、暗培养5 d，用直径4 mm的打孔器在近菌落边缘1/3处打孔，制成接种菌丝圆碟。取适量的嘧菌酯母液，加入溶化后冷却到50 左右的LBA培养基中，混匀，制成0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0g /mL梯度浓度的LBA平板。待培养基冷却后用接种针挑取菌碟，菌面向下接于含毒培养基中心，每皿1块。放入恒温箱中，25 下培养5d用十字交叉法测量菌落直径，每处理4皿，试验重复3次。测量菌落直径，依下式计算不同浓度药剂对疫霉菌菌丝生长抑制率:生长抑制率（1-药剂处理菌落直径4）/(对照菌落直径4)×100%计算抑制率几率值和浓度对数值的毒力方程，毒力公式计算嘧菌酯对疫霉菌各菌株的抑制中浓

11、度EC50及相关系数r值5。数值统计计算用SAS程序进行。对54个菌株的EC50进行正态分布检验，确定是否符合正态分布。正态分布检验用SAS程序进行。1.3 辣椒疫霉游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性测定参照Matheron等的方法6，从生长在LBA平板上的疫霉菌落边缘1/3处打直径为5 mm的菌碟4块，置于直径为9 cm的培养皿中，加入含有0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0g /mL嘧菌酯的无菌水5 mL，使得液面刚刚没过菌丝块，24 下光暗交替（12 h12 h）培养3 d后，倒去无菌水，在菌碟上滴加少许酸性品红，1015 s后滴加乳酸直至洗去大量品红。游动孢子囊呈现红色，在菌碟上随

12、机挑取3个视野，在显微镜下对游动孢子囊进行计数，每处理4皿，试验重复3次。同菌丝生长抑制试验，计算54个菌株的EC50，并进行正态分布检验。2 结果与分析2.1 辣椒疫霉菌的分离从广东省广州番禺、韶关始兴、阳江阳西、湛江雷州、茂名信宜以及惠州博罗等辣椒疫霉病经常发生的地区采集的辣椒疫病样本，经分离、纯化和鉴定后，确认得到了54个辣椒疫霉菌菌株（表1）。2.2 辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性水平测定2.2.1 辣椒疫霉病菌菌丝生长对嘧菌酯的敏感性对单孢分离得到的54个单孢菌株，采用菌丝生长速率法测定各菌株的EC50（表1）54个辣椒疫霉病菌菌株对嘧菌酯敏感性测定的结果表明，病菌群体对嘧菌酯敏感性表现

13、没有太大差异，如EC50最高为湛江雷州的LZ9，EC50为1.950 9g /mL，而惠州的HZ1菌株EC50最低，只有0.142 8g /mL，供试54个菌株的平均EC50为0.964 9g /mL。在疫霉菌对药剂的敏感性变化范围内，将EC50等分为16个阶段，统计每个阶段菌株的个数和频率，然后以每个阶段EC50的中值为横坐标，频率为纵坐标，作出频率分布图（图1），图中的峰代表病原菌群体对药剂的敏感性分布；同时，采用SPSS敏感性分布进行了K-S正态性检验，得Z=0.711 4，p=0.692 0，EC50表现连续性，则说明这54个菌株对嘧菌酯不同敏感性菌株的频率分布符合正态分布，辣椒疫霉自

14、然种群对嘧菌酯没有明显的抗药性。表1 辣椒疫霉菌菌丝生长对嘧菌酯的敏感性1）菌株回归方程（y）相关系数（R）EC50 /g·mL-1菌株回归方程（y）相关系数（R）EC50 /g·mL-1PY10.9832x+5.52430.99870.2929YX91.2122x+4.94300.99661.1143PY21.2836x+5.55530.98320.3693YX100.8168x+5.29780.97110.4319PY31.1641x+4.70060.99291.8080YX110.6978x+4.89220.99671.4272PY41.3078x+5.57300.9

15、8340.3646LZ10.7669x+4.91480.99071.2915PY51.0264x+5.27170.99700.5436LZ21.3398x+5.52020.99320.4090PY61.1001x+4.93670.99851.1417LZ32.3323x+4.75780.99971.2701PY71.2647x+5.37260.99880.5074LZ40.7503x+4.89570.99691.3697PY81.0592x+4.86280.99611.3475LZ52.5769x+4.55960.99721.4822PY91.2651x+5.02000.98850.9642L

16、Z61.0044x+5.39370.97990.4055PY101.1694x+5.10490.99880.8134LZ71.1274x+5.06960.98610.8675SX10.7901x+4.94160.99831.1855LZ80.8247x+5.0130.99550.9643SX20.8420x+4.93190.99811.2047LZ91.2603x+5.46720.99930.4259SX31.3322x+5.08750.98250.8596XY11.1030x+5.60530.93330.2826SX41.0100x+5.04720.99470.8980XY21.0469x+

17、4.86740.99331.3386SX50.7942x+4.76950.99291.9509XY31.0356x+5.24520.99900.5797SX60.7188x+5.07550.99350.7852XY41.1231x+5.03620.99870.9285SX71.0344x+4.85590.99731.3782XY51.1893x+4.73070.99741.6844SX81.1337x+4.85370.98471.3460XY61.2667x+4.71110.99911.6907SX91.0711x+4.93390.98861.1527XY71.0381x+4.99150.98

18、951.0190YX10.7758x+4.96800.99761.0996XY80.9997x+4.95250.99351.1156YX20.3957x+5.31420.99160.1607HZ10.5369x+5.45380.95830.1428YX31.1727x+5.05700.99920.8964HZ21.4858x+4.58770.94921.8945YX41.9538x+4.87060.99941.1647HZ31.0355x+5.53090.98660.3071YX51.3459x+5.41370.99800.4927HZ40.5349x+4.97930.94001.0900YX

19、61.2973x+5.03590.99490.9383HZ51.1041x+5.14310.99790.7420YX70.8754x+5.02490.96530.9366HZ61.3389+4.76690.99411.4931YX81.1697x+4.87470.99171.2797HZ71.1089x+5.37670.95890.45741） 试验设3个重复，EC50为根据毒力方程的计算值。因此对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂而言，病菌群体基本还处于原始种群，故此试验测定得到的54个菌株对嘧菌酯的平均EC500.964 9g /mL，可作为辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性基线。敏感性频率/%EC50/&#

20、181;g·mL-11图1 辣椒疫霉病菌54个菌株菌丝生长对嘧菌酯敏感性的频率分布2.2.2 辣椒疫霉病菌游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性嘧菌酯对54个辣椒疫霉病菌游动孢子囊形成的EC50为0.001 00.084 4g /mL（表2），平均EC50为0.023 9g /mL。嘧菌酯浓度为0.05g /mL时，对敏感菌株孢子囊形成的抑制率达89.4%，说明嘧菌酯对辣椒疫霉游动孢子囊形成有强烈的抑制作用，比对疫霉菌菌丝的活性高40.4倍。表2 辣椒疫霉菌游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性1)菌株回归方程（y）相关系数（R）EC50 /g·mL-1菌株回归方程（y）相关系数（R）EC

21、50 /g·mL-1PY10.9780x+6.96030.89340.0010YX90.7701x+8.24680.98100.0146PY21.1502x+6.93400.96980.0208YX101.0530x+6.89650.99460.0127PY31.0786x+6.76030.97280.0233YX110.8540x+6.09620.98910.0521PY41.0405x+6.17020.96980.0751LZ10.7425x+5.77450.97630.0906PY51.6625x+7.60010.99930.0273LZ20.8275x+6.52440.973

22、10.0144PY61.5561x+8.10300.99570.0116LZ31.0697x+6.65950.97270.0281PY70.9860x+6.65970.93870.0193LZ40.9181x+6.38610.99100.0309PY81.0204x+6.62420.99470.0256LZ51.0918x+6.92000.98950.0174PY91.0640x+6.96100.97430.0144LZ61.0702x+6.96080.97040.0147PY101.4143x+7.27300.97710.0247LZ70.9539x+6.73000.98390.0154SX

23、11.1059x+6.81880.99460.0199LZ81.2486x+6.45960.88360.0416SX21.5173x+7.59970.97960.0194LZ90.8237x+6.61790.93880.0109SX30.7705+x6.33830.94560.0844XY11.0663x+6.47930.99430.0411SX41.2214x+7.05390.99700.0208XY20.8667x+6.36330.94680.0267SX50.9258x+6.65470.99310.0163XY30.9131x+6.91060.94100.0081SX62.0129x+8

24、.73420.99890.0140XY41.5144x+7.84780.98070.0132SX70.9850x+6.55220.98980.0266XY51.6632x+7.40720.97710.0357SX82.3708x+9.01160.99640.0203XY60.8617x+6.49960.97920.0182SX91.2291x+7.11310.90470.0236XY71.3242x+7.02110.93280.0298YX10.9824x+6.63580.96340.0215XY80.8574x+6.35590.87360.0263YX23.1634x+9.11751.000

25、00.0116HZ11.0672x+6.74211.00000.0233YX30.9334x+6.53230.95190.0228HZ20.9738x+6.70730.96150.0177YX41.4299x+7.71140.95010.0131HZ30.7385x+6.38240.89890.0134YX50.9297x+6.6225.0.95280.0180HZ40.8944x+6.86320.94880.0083YX61.5830x+8.04690.97190.0119HZ51.3977x+7.15830.98300.0286YX71.2486x+6.99400.88380.0253HZ

26、60.8853x+6.45400.98470.0228YX81.7242x+8.22191.00000.0135HZ70.7195x+6.36000.97520.01291） 试验设3个重复，EC50为根据毒力方程的计算值。采用SPSS敏感性分布进行了K-S正态性检验，得Z=1.671，p = 0.0075，游动孢子囊对嘧菌酯的敏感性没有呈现正态分布的规律（图2），部分菌株EC50频率分布有拖尾现象。这表明，在自然种群中，有部分自发突变的菌株有一定的耐药性。EC50/µg·mL-1敏感性频率/%图2 辣椒疫霉病菌54个原始菌株游动孢子囊形成对嘧菌酯敏感性的频率分布3 结论与

27、讨论在广东省不同地区采集分离了54个辣椒疫霉病菌菌株，对这54个菌株进行嘧菌酯的敏感性测定表明，广东省辣椒疫病菌的菌丝生长和孢子囊形成对嘧菌酯均具有较高的敏感性。54个菌株菌丝生长的敏感性符合正态分布，菌株间的EC50分布连续，但部分菌株孢子囊形成对嘧菌酯有一定程度的耐药性，EC50具有拖尾现象。辣椒疫病在发病初期田间易形成发病中心，病部在高湿条件下可形成大量游动孢子囊，并释放游动孢子。游动孢子囊和游动孢子均可成为再侵染源，侵染健康植株。试验结果表明，嘧菌酯对辣椒疫霉菌丝生长的抑制效果低于其对游动孢子囊的抑制效果。因此，在发病初期使用较低浓度的嘧菌酯可有效地抑制发病中心游动孢子囊的形成，从而对游动孢子囊及游动孢子的萌发起抑制作用，可以有效地抑制病原菌的再侵染，对病害的传播和流行起到很好的控制作用。以有效中浓度（EC50）为参数，嘧菌酯抑制菌丝生长的活性比抑制孢子囊形成要低25.3倍，说明了嘧菌酯对菌丝生长的抑制活性较低，对已发病的寄主治疗效果较差。建议在防治辣椒疫病时应在发病初期