仔猪黄痢病原菌药敏实验

1、引言仔猪黄痢是由产肠毒素性大肠杆菌引起的临床常见的传染病，又称初生仔猪大肠杆菌病或仔猪早发性大肠杆菌病, 大肠杆菌是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成成分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性，尤其是对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症1。产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是一类致人和幼畜（初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪）腹泻最常见的病原性大肠杆菌，由粘附素和肠毒素共同作用而致病。初生幼畜被ETEC感染后常因剧烈水样腹泻所致脱水而死亡，发病率和死亡率均很高，如仔猪黄痢。在猪的规模化养殖中，仔猪

2、黄痢是危害严重的常见多发病之一，仔猪十分易感。该病具有很强的条件致病性，饲养管理不良，猪舍卫生条件差，天气骤变，供水不足和拥挤等诸多应激因素均可使猪只抵抗力降低而诱发本病。仔猪黄痢、白痢在世界各地均有报道，美国新生仔猪下痢中48% 是由大肠杆菌引起的。朱瑞民( 1988) 统计表明, 台湾有15 25%的仔猪因此病无法育成, 每年直接损失316 619 亿元; 据统计, 我国1997 年1 6 月猪大肠杆菌病发病数104511 头, 直接经济损失达5 千万元以上。由于仔猪黄、白痢及与其他病混合感染, 使提仔猪死亡率达60% 以上。随着养猪业的规模化发展，该病发病率有明显上升趋势，危害十分严重，

3、造成巨大的经济损失5。近些年来，抗菌药物的耐药性变为全球关注的热点，英国上议院和WHO报告表明抗菌药在家畜中的滥用和不合理应用是抗菌药物耐药性产生的重要源头。由于抗菌药物的长期使用，造成猪源大肠杆菌耐药株越来越多，耐药谱越来越广，多重耐药性呈上升趋势。方雨玲6等(1992)用18种抗菌药物对231株ETEC菌株进行了敏感性结果表明氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、强力霉素、四环素、氯霉素、磺胺、痢特灵等原来对革兰氏阴性杆菌有很强抑菌或杀菌作用的药耐药性显著增加，四环素、土霉素等已极少有敏感菌株，对革兰氏阳性菌杀菌作用的红霉素等对本菌基本没有作用。因此有必要通过大肠杆菌的药敏试验为临床用药提供依据

4、。1 材料和方法 11 实验材料临床菌株：从黄痢仔猪中经分离鉴定得到的大肠杆菌药敏质控菌株：ATCC 25922大肠杆菌，购于中国兽药监察所 药敏纸片：洁霉素、强力霉素、红霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、氨苄西林、复方新诺明、羧苄青霉素、先锋霉素IV、先锋霉素V 、丁胺卡那霉素、磺胺甲基异恶唑、环丙沙星、奥复星、新霉素 、链霉素、庆大霉素、阿莫西林、恩诺沙星、氟苯尼考购于佰易聚生物商城 抗菌药物贮存液：卡那霉素溶液、盐酸恩诺沙星水溶液购于浙江国邦药业有限公司，批号：110131291普通营养肉汤培养基、普通琼脂培养基购于广东环凯微生物科技有限公司1.2 实验仪器 净化工作台、天平、试管、三角瓶

5、、培养皿 、酒精灯、高压灭菌锅、干燥箱、培养箱、酒精灯、镊子、接种环、玻璃移液管、移液枪、试管架、烧杯、玻璃棒、游标卡尺。1.3 培养基的制备1.3.1 普通肉汤培养基的配制步骤：（1） 称量 用天平按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g准确称量，置于烧杯中再加入1000ml蒸馏水搅拌均匀。粉末状原料用滤纸直接称量，固体状用烧杯称量。 （2） 配制 将上述成分混合加热溶解，搅拌使其混合均匀，以看到气泡完全溶解为宜。加热时要控制火力，不要使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发的水分。 （3） 调节PH值 待配制好的培养基稍微冷却后，用玻璃棒蘸取少

6、许，用标准pH试纸测其酸碱度，初配好的牛肉膏蛋白胨培养液是偏酸性的，故要用NaOH调整。为避免过碱，应缓慢加入NaOH，边加边搅拌，并不时地用PH试纸测试，调整pH至7.2-7.4。也可以取培养基5ml于干净试管中，逐滴加入NaOH调pH至7.4-7.6，并记录NaOH的用量，再换算出培养总体积中须加入NaOH数量，即可调至所需的pH范围。（4） 过滤 将pH测定后的肉汤培养基用滤纸过滤（5） 分装根据需要，将完全溶解并调好pH的肉汤培养基溶液，乘热倒入三角瓶（装量不超过容积1/2）和试管（装量为管长的1/4-1/5），然后给三角瓶和试管都塞上棉花塞。试管要摆成斜面，可在桌子上放一跟玻璃棒，然

7、后再把试管口一边放在玻璃棒上是培养基溶液形成斜面。（6） 灭菌将分装好且塞上棉塞的三角瓶用报纸包住并用绳子绑紧；将分装好的试管塞上棉塞，再用报纸包住试管口的那一段，一次可以包810支，然后用绳子绑住，放入高压蒸汽灭菌锅内的套筒中，将灭菌锅盖的排气管插如套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，高压灭菌，121灭菌15-30min.1.3.2营养琼脂培养基的配制固体培养基的配置中，在称量、调配、PH值调节上都与液体培养基一致。营养琼脂培养基配方：蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g,氯化钠5g,琼脂14g，蒸馏水1000ml，最终PH 7.2±0.2。(1)分装将校正PH值后的培养基趁热分别装入

8、试管（装量为管长的1/4-1/5），试管培养基要做成斜面（可在实验台上放一支玻璃棒）。(2)灭菌把分装好的试管培养基用棉塞塞住试管口，用报纸包好，再用绳子绑紧，放入高压灭菌锅内开始灭菌。(3)倒平皿在超净工作台上点上酒精灯，把三角瓶内已灭菌好的培养基倒入已灭菌好的培养皿。注：倒平皿时要在酒精灯下操作，平皿口和三角瓶口先在酒精灯上烘烤一会儿再开始倒平皿，倒好后摇晃平皿使其均匀覆盖在平皿底部，放置一边使其冷却。选用90mm的培养皿，装量约为20mm，待冷却固定后倒置。1.4 培养基的培养把上述配制灭菌好的培养基放在37恒温箱中培养24小时左右，平皿要倒置培养。待培养后观察其细菌生长状况，无细菌生长

9、方可使用。2.试验方法2.1平板菌落计数法(1) 编号 取无菌培养皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套，另取8支盛有4.5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。(2)稀释 用1ml无菌吸管精确地吸取0.5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出事，管内液外外溢。然后仍用此吸管将管内悬吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0.5ml放入10-2试管中，吸吹三次，其余依次类推。液来回吸吹三次。(3)取样 用3支1ml无菌吸管分别精

10、确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0.2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。 (4)倒平板 于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45左右的普通琼脂培养基约10-15ml，置水平位置，迅速旋转混匀，待凝固后，倒置于37温度中培养24h。(5)计数 培养24h小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个培养皿上的菌落平均数，并计算每毫升中活菌总数。计数平均结果为每毫升中活菌总数为4.4×108CFU/ml,可判断菌落数符合标准，可以进行药敏纸片扩散试验。2.2药敏纸片扩散法2.2.1标准浊度管的配制 0.5麦氏比浊管配制方法：配制0.048M BaCL2 (1.17

11、% W/V BaCL2 . 2H2O)0.5ml和0.36N H2SO4 (1%, V/V)99.5ml。将二液混合摇匀，置试管中，每管装4-6ml，其浊度相当于麦氏比浊管第一管的1/2，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6月，使用前充分摇匀，在自然光下透光比浊。2.2.2菌株的培养及菌液制备分离得出的菌种，用接种环挑取一环，在斜面试管培养基上划线，然后放置在37恒温箱中培养，以待备用。将上述固体斜面培养基中的菌落用灭菌的接种环挑取45个接种在45ml的普通肉汤培养基内，于37培养78小时，再与0.5麦氏标准浊度管比较，如果浓度过大，可用灭菌生理盐水或者肉汤培养液稀释，使其浓度与浊度管相当。2

12、.2.3平皿的涂布、贴片 (1)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个琼脂培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀，因轻轻涂布防止刮破平皿。(2) 待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴4张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。在菌接种后15分钟内贴完纸片。(3) 将平皿反转，孵育1824小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录（见结果表1）。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生

13、长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。(4) 每次药敏试验必须用ATCC 25922大肠杆菌做质控。只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才可以报告。ATCC 25922的结果必须同时记录于结果表2中。2.2.4 抑菌圈的判定标准敏感（susceptible，S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制。耐药（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。中介（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度

14、的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。抑菌环直径在 15mm以上为敏感S青霉素高敏为 20mm以上 )，1015mm为中度敏感I，10mm以下为耐药R。2.3 稀释法2.3.1抗菌素液的制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000g/ml(如1280g/ml)或10倍于最高测定浓度，溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。恩诺沙星按其效价配成1280g·mL-1，卡那霉素按其效价配成5120g·mL-1于-20储存备用。2.3.2菌液的制备用接种环挑取形态相似待检大肠杆菌菌落3-5个，接种于4-5ml普通肉汤培养基，37培1618h,增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或肉汤校正

15、浓度至0.5麦氏比浊标准。试验前用灭菌肉汤培养基稀释使其浓度大致达到105CFU/ml备用。2.3.3试验步骤 (1)取100支试管，分五组，每组20支试管，编1-20号，在第1管中加入4.5ml普通肉汤培养液，其余试管中个加入2.5ml普通肉汤培养液。 (2)于第1管中加入0.5ml1280g/ml的恩诺沙星。用移液枪混匀后吸取2.5ml至第2管，混匀，再取2.5ml至第3管，依次类推至第19管，弃去2.5ml,第20管为不加入恩诺沙星的肉汤液，作为生长对照。此时各管药物浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/

16、256、1/512、1/1024、1/2048 g/ml。 (3)各个试管中均加入0.1ml稀释后菌液，使每管菌液浓度约为105CFU/ml，塞入棉塞，其它四组均按以上操作进行。将五组试管均置于37恒温箱中培养1624h后观察结果，以无菌生长的最低浓度为MIC。 （4)卡那霉素MIC测定步骤同以上，各管药物浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512g/ml。2.3.4抗菌素的最低抑菌浓度（MIC）值判断标准 抗菌素 浓度 相对应MIC值（g/ml） R S 卡那霉素 5120g/m

17、l 25 16 恩诺沙星1280g/ml4 13.试验结果3.1 药敏纸片扩散法结果表1临床分离大肠杆菌纸片扩散法结果抗菌药物 抑菌圈直径（mm） 敏感度洁霉素 0.00mm 强力霉素 7.10mm R 红霉素 0.00mm 四环素 6.90mm R卡那霉素 22.70mm S青霉素 0.00mm 氨苄西林 8.10mm R复方新诺明 8.70mm R羧苄青霉素 7.52mm R先锋霉素IV 17.30mm S先锋霉素V 20.30mm S丁胺卡那霉素 20.90mm S磺胺甲基异恶唑 7.66mm R环丙沙星 12.80mm I奥复星 11.60mm I新霉素 16.20mm S链霉素 9.

18、52mm R庆大霉素 20.60mm S阿莫西林 8.44mm R恩诺沙星 8.42mm R氟苯尼考 20.90mm S注：R为耐药 I为中度敏感 S为敏感 为不敏感3.2 质控大肠杆菌扩散法结果表2 ATCC 25922大肠杆菌纸片扩散法结果 抗菌药物 抑菌圈直径 敏感度洁霉素 0.00mm 强力霉素 18.48mm S红霉素 0.00mm 四环素 24.36mm S卡那霉素 18.90mm S青霉素 0.00mm 氨苄西林 17.78mm S复方新诺明 20.58mm S羧苄青霉素 18.80mm S先锋霉素IV 19.18mm S先锋霉素V 21.48mm S丁胺卡那霉素 17.90mm

19、 S磺胺甲基异恶唑 18.62mm S环丙沙星 33.22mm S奥复星 28.64mm S新霉素 19.32mm S链霉素 22.10mm S庆大霉素 20.78mm S阿莫西林 18.04mm S恩诺沙星 16.46mm S氟苯尼考 21.20mm S注：R为耐药 I为中度敏感 S为敏感 为不敏感3.3 MIC测定结果 (1)测定恩诺沙星最小抑菌浓度结果为五组实验都是第5管开始浑浊，前面4管液体清澈，无浑浊现象。说明第4管浓度是抑制细菌生长的抗生素的最高稀释浓度作为抗生素的最低抑菌浓度(MIC)，所以恩诺沙星的最低抑菌浓度（MIC）值为16g/ml，表现为不敏感耐药。(2) 测定卡那霉素最

20、小抑菌浓度结果为有四组实验为第8根试管浑浊，有一组实验为第9根试管浑浊。说明第7管药物浓度是抑制细菌生长的抗生素的最高稀释浓度作为抗生素的最低抑菌浓度(MIC),所以卡那霉素的MIC值为8g/ml，根据判断标准判断为敏感。4.讨论 在细菌的药敏试验中，较为常用的试验方法也就是药敏纸片扩散法和稀释法。纸片扩散法以测量抑菌圈来判定敏感、中介度或耐药。结果会受多种因素的影响，如接种菌量、孵育时间、抗菌药物的含量及扩散力、所用平皿琼脂的厚度、药敏纸片本身的因素等。还有倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.2-7.4)。pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。另外，药敏纸片必须放在干燥密封的条件下保存。然而纸片扩散法也有很多优越性，如方