酶促反应动力学试验

1、酶促反应动力学实验作者:日期:酶动力学综合实验实验（一）碱性磷酸酶Km值的测定【目的要求】1. 了解底物浓度对酶促反应速度的影响2 .了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求 Km值的方法。【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、 骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性 磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。2、米氏方程：Michaeli s- Men ten在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：* _ 国 砧+ 5（1）式中：v表示酶促反应速度，'聘表示酶促反应

2、最大速度，S表示底物浓度，表示米氏常数。3、值的测定主要采用图解法，有以下四种： 双曲线作图法（图1 -1,a）根据公式（1 ），以v对s作图，此时1/2时的底物浓度s值即为Km值,以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓 度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而1 / 2一不精确。此外由于v对S的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。 Lin eweaver - Burk作图法双倒数作图法（图1-1 ,b）实际工作中，常将米氏方程（式（1）作数学变换，使之成为直线形式，测定要方 便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数,变换为L in eweave r

3、- Burk方程式：2二上斗斗丄v Vmax SV 皿业把直线外推0以对=作图,即为y= ax+ b形式。此时斜率为 ，纵截距为十与横轴相交，其截距相交，其截距即为一=。 Ho fste e作图法（略） 把（2 ）式等号两边乘以二.，得:v = 嗥占+ &胡以v对一作图，这时斜率为-一，纵截距为，横截距为L4''理也 Ha nas作图法（略）垄。把（2）式等号两边乘以S,得:以一对s作图，这时斜率为.，纵截距为甘1中 EnajcLe weaver- B urk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸

4、苯 二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10. 0,和60C）,准确反应13分钟。在 碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长62 0nm比色。在一定条件下色 泽深浅与光密度成正比。反应式如下：oL嚼试剂礫担鸭酸）一一亠蓝鱼化合物I然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度， 即以光密度的倒数作纵坐 标,以底物浓度的倒数作横坐标，按L in eweave r - B urk作图法来测定碱性磷 酸酶Km值。【仪器与试剂】仪器：1. 恒温水浴2. 72 1型分光光度计试剂：1. 酚试剂：称钨酸钠（粧WI 2 _0） 100g,钼酸钠（民环M o_ 2 一 O）25g置1 5 0 0mL磨口

5、回流装置内，加蒸馏水70 0 mL,85%磷酸50mL和浓硫酸1 0 0mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶 液溢出），再加入硫酸锂（L iS O4）15 0g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通 风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000m L，过滤即成, 此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。 使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。2. 2. 5m M磷酸苯二钠基质液：称取6 25mg磷酸苯二钠（C 6H5P O4Na22 H2O）

6、溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置 冰箱内可保存一年之久。3. 碱性缓冲液（pH10.0）:称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸 馏水中，并稀释至1,0 0 0m I.4. 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1 mg，加水34ml，冰箱内可保存五周左右。 【实验步骤】取6支试管按下表加入试剂:1234562.5 mM磷酸苯二钠（ml）0.20 .40.60 .81 .01.0蒸馏水（ml ）0. 8r 0.60 .40 .2-0 .1碱性缓冲液（ml）1 .01. 01.01 .01. 01.0混匀后,60C欲温5分钟碱性磷酸酶液0.10.10.10

7、.10.1-(ml)混匀后，6 0C水浴13分钟（准确计时）注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加2）此时为酶促反应，总体积2. 1ml3 ）第六管不加酶。酚试剂（m 1 ）1.O1. 01.01 .01.01 .010%Na2CO3(ml)3.03. 03.03. 03.03. 0混匀后，室温放置15分钟注意:1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试 剂后酶促反应即停止。2）N a 2CO3提供碱性环境，加入Na2CO3后试剂才显色以6管为调零点，在62 On m波长处比色【结果处理】1将各管光密度和底物浓度记入下表管号O.D1/O.DS 1/ S123452以1/O.D

8、为纵坐标，1 /s为横坐标，按Lin ewea ve r- B u r k作图，求出碱 性磷酸酶的Km值。【注意事项】1 ）加入碱性磷酸酶的量要准确2 ）保温时间要准确准确保温的方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔 1分钟向下一只试管加酶 液，直至加完，到准确13分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔1分 钟向下一只试管加酚试剂，直至加完止，这样保证每管准确保温 13分钟。【思考题】1）Km的意义及其影响因子2）为什么酶促反应速度以初速度表示3）为什么O .D可直接代替V作图4）分析自己的实验数据实验（二）一一温度对酶活性的影响【实验目的】了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶

9、特性的认识。【实验原理】每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会 使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。【仪器与试剂】仪器：1 .冰箱和试管架2 .恒温水浴锅3 .试管4.吸量管及吸量管架7.烧杯5.移液枪及枪头6 .胶头滴管试剂：1 .PH6. 8的缓冲液：量取1 5 .45ml的0.2 M磷酸氢二钠和4.55ml的柠檬 酸混合摇匀即可。2. 0. 5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶 于1 0 0 m l蒸馏水（需加热）。3. 0. 03

10、1 7 5 g/L 碘液4. 1M H CI溶液5.1M NaO H溶液6 .稀释10 0倍的唾液7 .冰水浴【实验步骤】1 .制管和预温由于本实验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，分别标记 为A管和E管，同时欲温底物与酶。A管加入PH 6.8的缓冲液和0. 5 %£粉液;B 管使用移液枪加入稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温 5mi n0取12支洁净试管，参照下表加入试剂:管号1(0C)2（室温）3(37C)4( 50 C)5(70C )6（室温）APH 6.8 的缓冲 液（m1 ）222222含 NaCI 的 0. 5% 淀粉液(m l)222

11、22用2m 1的蒸馏 水代替B稀释1 0 0倍的唾 液（ml）111111* 6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水 代替2 .混合A、B管将1号A管试剂迅速加入温度对应的 B管中（为了最大限度保证酶的量）, 此时为计时的起点（使用秒表）,摇匀后放回对应温度继续水浴。 注意：转移A管 试剂前需将其摇匀。3. 时间控制然后每隔1min或2mi n（时间自定）按上步操作依次把2、 3、4、5、6号的 A、B管混合，严格控制好时间。4. 中止反应准确反应13min，向1号管加入2滴1M HC l溶液，立即混匀，中止反应， 按上一步的顺序和时间间隔依次对各管进行操作 ，并移至试

12、管架。后再各用2滴 1M N aOH容液中和每管。5. 显色在每管中各加入2m I 0.0317 5g/L碘液并混匀，观察现象。6 .比色若不同温度梯度间现象差别不明显，则进行比色 ，通过光密度值来比较。 【结果处理】记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。【注意事项】 严格注意时间的控制及各物质的添加量。【思考题】 如果某同学（没有严格按照教案步骤）做出的实验结果为唾液淀粉酶的最适温度 为70度，请分析他得出这样的结果的可能原因。实验（三）P H对酶活性的影响【实验目的】了解PH对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】1. P H对酶活性影响的机理:PH影响酶活性中心

13、的某些必须基团的解离，而 这些基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有最大催化活性；PH影响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态，从而影响酶对他们的亲和力；PH还可 以影响酶活性中心的空间构象，从而影响酶的活性。2. 本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受PH的影响的情况。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解 ，从而得到各种糊精乃至 麦芽糖,少量葡萄糖等水解产物。碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应呈现 不同颜色，即淀粉（蓝色）、紫色糊精（紫色）、红色糊精（红色）、麦芽糖及少量葡 萄糖（黄色）。【仪器与试剂】仪器：1、冰箱2、电炉3、恒温水浴锅4、试管架及试管5、移

14、液管架及移液管试剂：1、0.2M磷酸氢二钠溶液：称取 3 5 .61g含2个结晶水的磷酸氢二钠， 用水定容至1L。2、0. 1M柠檬酸溶液：称取21.0 1g含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至1 L。3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释10倍、5 0倍和1 0 0倍，得三种不同浓度的 酶液、4、0.5 %淀粉的0 .5%氯化钠溶液：0. 5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于1 00m 1蒸馏水（需加热）。5、0 . 1%淀粉液：0. 1 g可溶性淀粉，加到100 m l蒸馏水中，加热溶解。6、碘液：1 5g碘化钾和1 2. 7g碘,加少许水使碘完全溶解后，再用水稀释 至 200ml。7、1 %氯化钠溶

15、液。8、0 .1 %硫酸铜溶液。【实验步骤】（一）P H对酶活性的影响1、缓冲溶液的配制 取六只洁净的三角烧瓶，按表1编号和加试剂：表1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制管号123456P H值5.46. 26 .87 .07.48. 0缓冲液量（ml）333333含Na cl的0.5%淀粉（ml）222222稀释100倍唾液（m 1）222222充分摇匀，37C水浴保温，严格控制时间 5min后，立即向各管加入碘液碘液（滴）333333充分摇匀，观察各管颜色差异取六支洁净试管，编号后按表 2操作：表2 pH对酶活性的影响【结果处理】记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析【注意事项】 充分摇匀，

16、严格控制时间。【思考题】酶的最适PH值受哪些因素影响？三角烧瓶号123456P H值5. 46.26 .87. 07.48 .00 .2M磷酸二氢钠（ml）11 . 1r 13. 215 . 4118.1719. 45256.4750.1M柠檬酸(ml)8.856.784.553 . 531 . 830. 55实验（四）酶浓度对酶活性的影响【实验目的】了解酶浓度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】在适宜的条件下，若反应物浓度大大高于酶浓度时，反应速度随酶浓度增加 而增加,两者间成正比。但若反应底物浓度较低，而且酶的浓度足够高时，增加 酶浓度，反应速度基本不变。本实验采

17、用唾液淀粉酶为例。加入不同浓度的酶，并比较在同一适当时间后 以碘检验淀粉的含量从而确认其反应程度。【仪器与试剂】仪器：1. 恒温水浴锅2. 吸量管3. 试管与试管架试剂：1. 含NaC I的0.5%淀粉液2. pH7.0的缓冲液3. 分别稀释过1 0倍、5 0倍和100倍后的唾液 【实验步骤】1 取3支洁净试管，按下表加入淀粉液，缓冲液，加毕放入3 7度恒温水 浴锅中保温5分钟；2保温后，快速加入不同浓度的稀释唾液，摇匀，立即放入3 7度恒温水浴中, 并计时。约3至4分钟后加入等量碘液一至两滴， 立即摇匀后,记录各管的颜色。管号含NaC I的0 .5%淀粉液 /mLpH7.0的缓冲 液/mL稀

18、释唾液/mL颜色10倍5 0倍100倍132123213321【结果处理】记录现象，做出合理分析【思考题】实验（五）离子对酶活性的影响【实验目的】了解离子对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激 活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。C是唾液淀粉酶的激活剂。其它的阴离子，女口 Br-、NO 3-和 I-对该酶也有激活作用，但较微弱。而 Cu2 +对唾液淀粉酶具有抑制作用。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且 常具有特异性。就本实验,低浓度CI-可以增加酶活性，高浓度的CI -或者低浓度的Cu 2 +则会 抑制酶活性，同时低浓度的 Na+、50 42-等对酶活性没有影响。激活剂的作用机 制是多种多样的，可能是作为辅酶或辅基的一个组成部分，也可以直接作为酶活 性中心的构成部分。【仪器与