荧光定量PCR引物设计原则

1、-作者xxxx-日期xxxx荧光定量PCR引物设计原则【精品文档】1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。2. 产物不能形成二级结构（自由能小于）。3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%60%之间，45-55最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5端可以修饰。9.3端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。10.

2、 引物3端要避开密码子的第3位。11.引物整体设计自由能分布5端大于3端，且3端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70或者有8个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。值在58-62度之间。17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引

3、物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： 引物长度 一般引物长度为1830碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5 在引物长度大于20bp时：(%G-C)-500/length-5 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54的最短的引物可获得最好的效率和特异性。 总的说来，每增加

4、一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。  GC含量 一般引物序列中G+C含量一般为40%60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5端加适量的A、T或G、C尾巴。  退火温度 退火温度需要比解链温度低5，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结

5、合。一对引物的退火温度相差46不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在5575间变化。  避免扩增模板的二级结构区域 选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。  与靶DNA的错配 当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软

6、件进行检测，网址：。选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。 可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度

7、有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。  引物末端 引物3端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。  引物的二级结构 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判

8、断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。  为了下一步操作而产生的不完全匹配 5端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。 很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还

9、需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。 a 添加限制性内切酶酶切位点 添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5端还需要加23个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：Sal不需要保护碱基，EcoR需要1个，Not需要2个，Hind 3个。其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考：原核表达之实验前的分析。里面一些规则是所有表达都通用的。 有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要

10、注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。不过这种方法虽然方便但并不推荐。有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。一旦出现问题，分析起来更麻烦。 b LIC添加尾巴 LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。用LIC 法制备的pET 载体有不互补的1215 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。T4 DNA 聚合酶的3'5'外切活

11、性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。 c 定向TA克隆添加尾巴 在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向”了。d In-Fusion克隆方法 这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的。此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量的转化。如果要加入额外的碱基总是或多或少