利用荧光显微技术研究生物单分子(精)

1、陈浩 200425023 分析化学专业近 20 年來光学探测方法竹了长足的进步。在 80 年代出现并逐渐成熟逹 的近场显微术为超衍射极限分辨成像提供了基木乎段，同时也便光学显 进入了纳米科学的领域。而共焦显微术不仅突破传统光学的衍射极限 耐为光学探测引入了第三维空间信息，使光学探测貝仃了层析能力，实现了真正 的空间三维成像。超短脉冲激光技术直接导致了多光子荧光显微术的成功。尤英是飞秒激光激 发的荧光显微术.对丁提取时间分辨的信息是有力的工具。这种荧光单分了 探测及单分子光谱探测与其数据处理方法的组介，形成了荧光共振能就转移 的探测方法。通过该方法可以获得 1 5 纳米8 纳米的空间分辨率的构像

2、信 息，达到光学方法上最高的分辨率。利用荧光显微技术研究生物单分子光学单分子方法的进展以上近场.共焦.荧光显微术和荧光共振能就转移四种基本技术构成了目前 活跃的生物单分子探测的光学平台。Myosin V的分子结构cargobindingdomainsheavychainmotordomai nschainsMyosin Vct-helicalcoiled coil肌球蛋白是包含 18 个不同子类的一大类蛋白分子马达， 但构型上都属于二聚体，有対个明显伸出的“头”，用于 附着在肌球蛋白丝上，这里我们干脆称之为“腿”。Myosin V的两种运动模型(1)在Hand-nvei一h and模型中，后腿

3、向前移动了74nm,而前腿没有移动。分子木身移动了37nm,染料移动了372xnm,(如果MyosinV的结构是不对称的，x为染料到 轴的平均距离)。(2)在inchworm模型中，myosin分 了的所有部份都向 前移动37nm,并且 有一个头始终与肌 球蛋白丝结合在 起。再用荧光显微镜来对标记的荧光分子进行检测。据此來研究myosin V的迈步过程。具体检测技术：全内反射荧光显微+共聚焦荧光显微物体表面以外的场分布可以划分为两个区域：距物体农而仅儿个波氏内区域，这区域称为近场区域;近场区域以外到无穷远是远场区。常规激发和收集均处于远场区域。在远场区域只存在可以向无穷远传播 的远场波（也称为

4、辐射波）。近场区域光场包括了限丁表面仅儿个波长内 存在的成分，即近场波（也称为非辐射波）；乂包括远场波。近场波也被称为 衰逝波，（隐失波）贞强度随离开农面距离指数衰减不能在自由空间心在。近场波体现了光在传播过程中，遇到空间光学性质不连续时,光波的空间瞬 态变化，这种变化很快在空间哀减，它反映了空间光学性质的不连续性。单分子荧光技术检测运动模型把一个荧光分子标记在myosin V |:主韻隸删臨辎豫丘内純偶极跃迁隔叱俪光在光密介质中传输，如果它以大 于临界角的角度入射到另一个折射 率较小的介质上.光就会发生全反 射。实际上.即使当角度He, 仍然会有-小部分能量以隐失波的 形式穿透到液体介质中，

5、4 “近场” 情况下，光沿平行界而传播。由金 内反射产心近场激发照明之后，利 用共焦或宽场去取像，即构成荧光 标记金内反射荧光显微镜。全内反射显微术典型的垂直照明深度100nmo这么薄的光学层析层切片意味着信噪比比共焦系统好得多，细胞的光损伤和光漂白也很小。其图像是通 过CCD相机来捕获的。这种仪器很灵敏或成像速度很快（但很少有CCD相 机兼有以上两个优点目前可达到的量子产率已到80% ,成像速率200帧/秒。共聚焦显微在光学成像系统屮利用两个焦点来生成物体的象一个籲 点为使用显微镜物镜把入射的激光在物体表而或内部形成 的。这个焦点便是一个象点，也是一个点光源。它可以是 反射的光，也可以是物体

6、受激发发出的荧光。这一象点再 通过另一个物镜成像在针孔孔径上，则生成了第二个焦点。 这两个焦点是共轨的（共焦）。通过沿 X 或 y 方向-点点地生成象点，综合成平 Ifij 图像，再 调|J z方咼生应象点，逼过计餘机合成三维函像 o隹內反射恵微所以共焦显微镜具有对细胞和光漂白区域进行深度三维成像 的能力。QuiekTiae步片纳米精度荧光成像技术 FIONAFluorescence imaging with one-nanometer accuracyinchworm 模型预测每步的长度应该是 37nm,分子本身移 动也是37nm ;而 hand-over-hand模型观测长度应该是分 子本

7、身移动位移的两倍一也就是 74 门“。为了测试这两个 运动模型，科学家开发了一种单荧光分子成像技术来定位, 误差可以小于1.5nm,并具有0.5秒的时间分辨率。 同时 可以拍摄几分钟的影像來观察。 全内反射荧光显微仃 IRF) 用來激发多个单个的荧光分子，并使用 CCD 來拍摄帧逐帧 连续图像(不存在帧间的失效时间)。单纳米精确荧光成 像(FIONA)技术比使用其它方法在常温下对单荧光分子定 位精确度提高了 20 倍，在成像能力上提高了 10 倍。使我们能够对中心区进行定位，偏差小于土 3nm, 比较亮的点，偏差小于1.51】叭 有些染料的闪 烁导致的亮度变化町以被观察到。_ _ Hand-o

8、ver-hand S iPobes：RB or Cy3在町 osiii V 的光链区用-个 RB 或 Cy3 灾 7C7? T3 标记。被标记的 myosin V 分子被加到肌动蛋口丝，(并用 TIRF來观察。荧光图像使用 0. 5s 的时间來收集。人概每 40|j iu*40u in 的区域内有 20 个点可 以被观察到。每个 FWHM 280nm,人约每个光斑在 每张照片上有 5000 到 10000 个光子被收集到，这在没伽TP存在时， 荧光光斑 ,加入300nm ATP之 识别到冇移动，口.ATP浓 度披人,平均移动率越瓠 总的说來，我们观察到49个 不同的标记上BR的mvosin V

9、分子并检测到总共552步。我 们观察了三个不同群体的myosin V分/群，显示出几种不 同的步氏， 有74nm的， 也是5 2/23之间变动的，或者42/33之间变动的，但没仃发现37n m长的o如何检测单生物单分子的尺度在 1 纳米10 纳米，冃前荧光标记的加 分子团在 100纳米左右。传统光学方法（远场显微镜）达矿 的最好分辨率是 250 纳米，共焦显微镜的分辨率仅提高了 1.4 倍2倍，荧光显微术可以再提高 2倍4 倍，但是 仍不能达到单分了级。因此日前利用荧光远场成像方法所 揭示的大部分是荧光团的行为。在分析了大量图像之后，发现大多数光斑都显示单个 的熄灭，表示这是单个的分子。测出的

10、步距只是单个 被标记的 myosin 分子的。mD D/w v A&6 (pNCl)MWiWUnDlr.T：myosin V 的运动是遵循 hand-over-hand 模型的, 两个头部交替附着在肌球蛋白丝上向前运动。以上是一个完整的利用单分子荧光技术來检测生物 大分子的例子。检测了38个myosin V分 子的365步，每一步都是 迈出74nmo其中32个 分了足够亮，町以产生 个大于10的信噪比SNR,在总共231步中。这些步 的柱状图显示平均步距为73.8土5.3nm（5.3nm为 平均标准偏差），这与正 态分布仃非常好地拟合（厂2=0.994, X2尸1.6刀。 同时也检测到

11、了6个按52/ 23nm交替前进的分 Q和6个按42/33交替前进 的分子。Xb HA wso eoTime (sec)如果是 inchworm 模型.每一步的长度应该都是 37nm 左右。Myosin V步距的统计Qtwnxi HXrm70.7 Z5 &*T9 1 ?3J) fWTW.o311.5 nmX1.6 nm73.7 JQeS 3nml&iaofrm o M rmBQCM,4 t4,5亦ma ti.zm电子扫描成像显微术及各类 卄光学的探针扫描成像显微 术均具有比光学显微镜更高 的空间分辨能力。但它们在 不同程度上存在着系统结构 复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁

12、琐等困难。而且它们均不能获得样品重 要的光学信息（例如：光的反 射率、折射率、偏振态及光谱等信息），特别是不能进行无损伤性生物活体探测，因而 无法完全取代光学显微成像 的地位。该技术可以从探测到的荧光强度随时间的变化来获得分 子之间的距离和方位的信息。它的原理如下：两个被不同荧光染料标记的分子或细胞的两部分，当它们相距在 10- 100 埃时，能量开始从给体荧光团传递到受体荧光团，即 产生能量共振现象，使该受主辐Myosin V walking along an actin荧光共振能量转移射光子。探测此能量转换的方法可以利川共焦显微术结合全内反 射显微术的方法。1-虽然光学方法对于探测单发光团分子是足够灵敏的，但它不可能 局部化这个探测点小到可以与一个分子尺度相比的程度。为了殴 进分辨率缩小光孔尺寸，需使本来很弱的光衰减得更弱。最终要 求在探测中不仅是探测到单分子荧光团的存在，而且要探测到单 分子的结构形状和行为。解决该问题的途径之一是使光学显微镜 的荧光高灵敏探测与原子力显微术相