第四章 基因操作的技术原理(电泳)

1、第四章第四章 基因工程的主要技术原理基因工程的主要技术原理 4.1核酸的凝胶电泳 1 定义：定义： 用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳等作为支持介用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。质的区带电泳法称为凝胶电泳。 v琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 适用于分离大分子核酸。适用于分离大分子核酸。v聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 普遍用于分离蛋白质及普遍用于分离蛋白质及 较小分子质量的核酸较小分子质量的核酸 2 2 基本原理基本原理 带有负电荷的带有负电荷的DNA或或RNA核苷酸链，依核苷酸链，依靠靠无反应活性无反应活性的稳定的支持介质和缓冲液，的稳定的支持介质和缓冲液，

2、在电场中以一定的迁移率从在电场中以一定的迁移率从负负极移向极移向正正极。极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将核酸分子混合物中的各种成分彼此分开。将核酸分子混合物中的各种成分彼此分开。 3 3 电泳的迁移率电泳的迁移率电泳迁移率取决于核酸分子本身的电泳迁移率取决于核酸分子本身的大小大小和和构型构型 1 1 分子量小的分子量小的DNA分子分子 分子量大的分子量大的DNA分子分子 线状双链线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分

3、子量分子量对数成反比对数成反比,分子越大则所受阻力越大分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而因而迁移得越慢。迁移得越慢。2 2 同等分子量的不同构型的核酸分子同等分子量的不同构型的核酸分子 共价闭环共价闭环 线性线性 松散型的开环松散型的开环 相同分子量的质粒其线状、开环和超螺旋相同分子量的质粒其线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的度是不一样的 。 4 凝胶电泳的分辨力凝胶电泳的分辨力 与凝胶的与凝胶的类型类型和和浓度浓度相关相关 琼脂糖凝胶的分辨力在琼脂糖凝胶的分辨力在0.160Kb之间之间; 聚丙烯酰胺的分辨力

4、在聚丙烯酰胺的分辨力在1bp1Kb之间之间 凝胶浓度越大相对分离的凝胶浓度越大相对分离的DNA片段越小片段越小 凝胶浓度越小相对分离的凝胶浓度越小相对分离的DNA片段越大片段越大 琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取出琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取出的线性多糖聚合物。的线性多糖聚合物。一一 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳包括：包括： 常熔点的琼脂糖常熔点的琼脂糖 低熔点（低熔点（LMP）琼脂糖）琼脂糖 LMP琼脂糖琼脂糖 性质：熔点：性质：熔点：6265 在在37 可保持液态数小时；可保持液态数小时； 在在25 可保持液态约可保持液态约10分钟分钟 用途：回收用途：回收DNADNA分子分子

5、 在在65 65 下将下将LMPLMP琼脂糖凝胶熔化；琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提加入过量的酚抽提DNADNA； 离心获得含离心获得含DNADNA分子的上清液；分子的上清液；特点：直接酶切特点：直接酶切 ；价格昂贵；价格昂贵1 琼脂糖凝胶电泳的参数：琼脂糖凝胶电泳的参数： （1） 缓冲液缓冲液 （2）凝胶的浓度凝胶的浓度 （3） 加加DNA样品：样品：1g，载样缓冲液，载样缓冲液(溴酚蓝，甘油溴酚蓝，甘油） （4） 电泳条件电泳条件 （5）染色和观察染色和观察 （1） 缓冲液： 常用的几种电泳缓冲液有：常用的几种电泳缓冲液有： TAETris-乙酸和乙酸和EDTA (pH8.0) TBE

6、(Tris-硼酸和硼酸和EDTA) TPE(Tris-磷酸和磷酸和EDTA) 一般配制成浓缩母液（一般配制成浓缩母液（10X或或5X）,储于室温储于室温。TAE、TBE和和TPE比较比较Buffer缓冲容量缓冲容量迁移速度迁移速度分辨率分辨率用途用途TAE最低最低最快最快(高高10)高分子量高分子量高高高度复杂高度复杂DNA混合物；超螺混合物；超螺旋旋DNATBE很高很高较慢较慢低分子量低分子量高高价格昂贵，不价格昂贵，不常用常用TPE（2 2） 琼脂糖浓度琼脂糖浓度与与DNA分子大小分子大小的关系的关系DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 分离的

7、分离的DNA片段片段0.5kb 所需胶浓度是所需胶浓度是1.2-1.5%, 分离的分离的DNA片段片段10kb 所需胶浓度为所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则片段大小间于两者之间则所需胶浓度为所需胶浓度为0.8-1.0%。 （4） 电泳条件电泳条件 在低电压时在低电压时,线状线状DNA片段的迁移速率与所加电压片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大因场强升高引起的迁移率升高幅度也

8、越大,因此电压因此电压增加增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。 大片断低电压长时间大片断低电压长时间 小片段高电压短时间小片段高电压短时间（5） 染色和观察：染色和观察： 溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide,EB）染色，）染色， 溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强。使其刚性更强。 1 常用的核酸染色剂是溴化乙锭（常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），）， 染色效果好，染色效果好， 操作方便

9、，但是稳定性差，操作方便，但是稳定性差， 具有具有毒性，致癌作用毒性，致癌作用。 2 SYBR Green ， GelRed 毒性小，但价格贵。毒性小，但价格贵。 3 GeneGreen 相比则是性价比高的低毒相比则是性价比高的低毒 替代染料，其灵敏度比传统替代染料，其灵敏度比传统EB染料高染料高10 倍以上。倍以上。溴化乙锭染料分子的化学结构及其溴化乙锭染料分子的化学结构及其对对DNA分子的插入作用分子的插入作用 用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤 v1. 根据欲分离根据欲分离DNA片段大小用配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量片段大小用配制适宜浓度琼脂糖

10、溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。缓冲琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。缓冲液体积应小于容器容积的液体积应小于容器容积的50%。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。v2 待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭（枪头沾取少许即可）。轻轻待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭（枪头沾取少许即可）。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。地旋转以充分混匀凝胶溶液。v3. 琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置在托盘底面上置在托盘底面上0.51.

11、0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。求的加样孔。v4. 浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。凝胶适宜厚度为浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。凝胶适宜厚度为35mm。v5. 让凝胶溶液完全凝结，室温下让凝胶溶液完全凝结，室温下20-30min。 小心拔出梳子。将凝胶小心拔出梳子。将凝胶安放到电泳槽内。安放到电泳槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液向电泳槽加入电泳缓冲液 。v6. 混合混合DNA样品和样品和0.2倍体积倍体积6指示剂。指示剂。v7. 用微量移液器将样品混合液用微量移液器将样品混合液缓慢缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量加至浸没凝胶的加样孔内。分

12、子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。v8. 关上电泳槽盖，接好电极插头。给予合适的电压。关上电泳槽盖，接好电极插头。给予合适的电压。 v9. 当当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电极插头和打开电泳槽盖极插头和打开电泳槽盖. v10. 转移凝胶至凝胶成像系统内观察。转移凝胶至凝胶成像系统内观察。 vhttp:/ 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简

13、称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法作为支持介质的电泳方法 PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等制备，还可测定分子量、等电点等 蛋白分子量与聚丙烯酰胺凝胶浓度对应关系蛋白分子量与聚丙烯酰胺凝胶浓度对应关系 SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺是为蛋白质电泳提供载体， 其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否， 与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9， 选择

14、Tris-HCL系统。 TEMED与AP(催化剂)：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固。 十二烷基磺酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白 质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白 分子内的疏水作用、去多肽折叠。 三 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 1984年D.R.Cantor发明，分离超大分子量的DNA分子（107bp的DNA大分子）。原理 在脉冲电泳中，电场方向呈周期变化，头一个脉冲电场在脉冲电泳中，电场方向呈周期变化，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成方向与核酸的移动方向成4545角，下一个脉冲的电场方向与角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成核酸移动方向在另一侧成45 45 角，由于加在琼脂糖凝胶电角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得着，这就使得DNADNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应分子必须随时调整其泳动的