土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究

1、的分析研究匕海交通大学附属中学 高二(9)班姜北辰201209232011-2冃录1、绪论2、实验材料及方法3、结果与数据分析4、分析总结与讨论5、参考文献摘要:通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化 能力的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，其二周吋间硝酸盐降解率 最高为100%,最低为66.76%o对此8株菌株的dna进行pcr扩增，引物为已 知的nirs和nosz反硝化基因的相应引物，发现有三株菌株含有nosz基因。再 对此8株菌株中的7株的16s rdna进行pcr扩增，鉴定菌种。关键词：反硝化微生物，菌种鉴定，反硝化菌筛选1> 绪论：反硝化作用

2、（denitrification）也称脱氮作用。反硝化细菌在缺氧 条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（n?）或一氧化二氮（n2o） 的过程。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单 胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可 用下式表示：c6h12o64-12no3 j 6h2o+6co2+12noi+能量ch3cooh+8no3j6h2o+ioco2+4n2+8oh+ 能量反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤屮氮索营养的 含量，对农业生产不利。农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分 接触以防止反硝化作用。反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节， 可使土壤中

3、因淋溶而流入河流、海洋中的no?减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。所以我们应 尽量发挥其有利的一面，为人类所 利用。current opinion in microbiology反硝化微生物对于硝酸根离 子的还原步骤如右图，若要从微生 物代谢角度验证菌株是否为反硝 化菌最简单有效的方法便是测定 nirs和nosz基因是否存在。由于 n20和no都是温室气体，是否含 有nosz基因对于菌种的用途有着 实际且重要的意义，即可以使土壤 屮微生物代谢产生的n2o和no还原成氮气。本实验的目的便是通 过筛选土壤中的反硝化菌，测定反硝化能力，鉴定其是否含有nirs 和nosz基因，对此进行综合分析，找

4、出反硝化能力较强的菌株，最 终制备纯培养的反硝化菌菌株。实验完成后，此菌株将有十分广大的 应用前景。例如，将对农田等生态系统中其他微生物产生的n2o和 no等温室气体还原，减少温室气体的排放，为维持环境的稳定起到积极作用。2、 实验材料与方法(1) lb液体培养基(每1000ml)10g蛋口腺5g酵母提取物10g nacl若加入15g琼脂粉则为lb固态培养基成分。(2) tsa培养基：胰蛋口月东0.75g/l大豆豚0.25g/lnacl 0.25g/l(3) giltay培养基a溶液：kno3 l.ogo天冬酰胺l.og, 1%btb酒精溶液5ml, 蒸啊水500mlb 溶液：柠檬酸钠 8.5

5、g, mgso4-7h2o l.og, fecl3-6h2o 0.05g, kh2po41.0g, cacl2-2h2o 0.2g,蒸馆水 500ml混合a、b溶液，加入l%mol/l的naoh溶液调节ph为7.1, 灭菌备用。(4) 琼脂糖凝胶电泳 全基因组电泳：tae buffer 30ml琼脂糖 0.8% (0.24g) pcr产物电泳：tae buffer 50ml琼脂糖 1.2% (0.6g)均加入荧光剂eb 1微升(5) bead-beater法所用试剂 bufferz : 10mm tris-hcl, 150mm nacl, ph 8.0(1.21g tris 碱,8.755g

6、nacl,加 hc1 调至 ph 8.0,配成 il 溶液) 10%sds(ci2h250s03na)100g 溶于 il 水 ph 5.3 氯仿异戊醇(24： 1) 苯酚(ph 8.0) 无水乙醇 eirconium beads screw tube(6) pcr反应体系(25 u 1)10 x buffer2.5 ultaq酶0.25 u 1mgc122p1dntp2ulprimerl0.5ulprimer 20.5 ul水16.25 ul模板lulnosznirsprimer 1nosz fr3cdprimer2nosz rcd3af(7) 修正pcr反应体系(50u l)10 x bu

7、ffer5ultaq酶1 u ldntp7ulprimer 11 ulprimer21 ii l模板1-2 uldmso1 ulddh2o33 ul(8) pcr反应引物序列及条件目的基因引物引物序列(5v)反应条件nirsl2cd3afr3cdgts aac gts aaggar acs gggas ttc ggr tgsgtc ttg a94°c for 2min,30x(94°c for 30s,51 °c for lmin,72°c for lmin),72°cfor lominnosz nosz fnosz rcgy tgt tcm

8、tcgaca gcc agcat gtg cag ngcrtg gca gaa94°c for 2min,3x(94°c for 30s,65 °c for 1 min,72 °c for 40s),4 x (94 °c for 30s,60 °c for 1 min,72 °c for lmin),18x(94°c for 30s,55 °c for1 min,72°c for 1 min),72°c lomin(9) 化学转化体系:pmd18-t 载体 0.5uldna4.5 ul

9、solution i5ul载体与solution i为takara公司产品（10）仪器、试剂：普通离心机、冷冻离心机、超净台、恒温培养箱、摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、紫外分光光度仪、pcr仪、凝胶电泳 槽、水浴锅、冰浴、金属浴仪、紫外照胶仪、快检器，实验所 用化学药品均为分析纯。（11）初筛：先将土壤样本稀释100倍作为样本。提取样本,稀释为10"、10 10_ 10 ios 10"六个梯度，各500微升。其中,10 10 w7三个浓度各涂两个平板，其余各涂一个平板。再加上10一2浓度在平板上进行划线，总计10个平板。平板上培养基为tsa培养基。然后将平板放入厌氧培养箱

10、中18°c培养一个星 期。（12）菌落集中培养：另取一平板，在其背面贴上50格的方格纸，然后从io6 和1（/7的平板上挑取菌体分别接种在每个格子的左上（记为a） 和右下方（记为b）。（其上菌落的编号方法：方格号+位置，例:10a、44b）o共计100个菌落。将此平板与先前各平板一道放入厌氧培养箱继续培养一周。此平板记作“平板a”（13）复筛:使用移液枪头挑取平板a上较明显且较有代表性的10个菌落接种进预先加好giltay培养基与btb的大试管内，记下编 号，培养一周。接种到大试管中的细菌编号：17a、17b、19a、19b、23a、23b、38b、41a、42a、43a。btb变蓝

11、的试管编号：17a、17b、19a、19b、23a、38b、41a、43ao将所有平板密封放入冰箱保存，将大试管放入振荡培养箱 继续培养。一周后，提取大试管中的培养液，开始测量硝酸盐 的降解程度。此时，菌已在大试管中培养三周（28°c）。使用仪 器为紫外分光光度仪，波长为220nm与275nmo记录实验数据, 将结果进行数学模型拟合，推算出硝酸盐降解程度。（14）dna提取与pcr扩增： 配制lb液体培养基100ml,取16个试管，将有反硝化能力的 8株菌株接种到试管中，进行好氧培养，16小时后放4°c保存。 使用煮菌法从平板a上提取dna,把已知的反硝化基因nirs 和n

12、osz基因为目的基因，使用相应引物，进行pcr扩增，电 泳后比对。通过研究比对看具有反硝化能力的菌是否含有这两 种基因。 取4°c保存的菌液使用bead-beater法提取高纯度dna。 用此dna作为扩增16s rdna的模板，引物为16s rdna全程 引物（27f、1492）o同时使用此dna对目的基因pcr作复核, 重复三次实验。（15）琼脂糖凝胶电泳（8个菌株的dna样品+阳性对照+阴性对昭)八、丿 使用30ml规格0.8%的琼脂糖tae buffer溶液，取全基因组dna样品3h1,无菌水2m1,缓冲液1u1在塑料膜上点样混 匀后注入凝胶的孔内，电压80v。使用50ml规

13、格的琼脂糖tae buffer溶液，取pcr扩增dna样品3ul,无菌水2叮，缓冲 液1卩1在塑料膜上点样混匀后注入凝胶的孔内，电压120vo 结束后放入喑箱内拍照，比对。(16) 16s rdna电泳产物的割胶回收制备回收胶，紫外灯下割取明亮条带于1.5ml ep管中。使用omega公司的dna回收试剂盒回收16s rdnao(17) 使用omega公司的dna回收试剂盒回收16s rdna 称胶重 加适量binding buffer(xp2)放入60°c水浴lomin使胶融化。 组装dna column和2ml收集管 加入7001h样品，loooxg离心lmin 倒去液体加700

14、 u 1 binding buffer(xp2)重复一次loooxg离心 lmin 最大转速空转2min,放65 °c烘箱5min 加dna洗脱缓冲液50ul, loooxg离心lmin(18) 化学转化 取感受态大肠杆菌细胞(dh10b),放冰上融化。 配制10卩1体系(t载体0.5u1, solution i 5 u 1,样品4.5ul) 加入转化体系后，冰上放置30min 42°c热激90s放冰上23min 加入lml lb, 37°c 1小时培养 涂布在加amp的固态lb上，培养16小时。 amp 固态 lb 成分:amp 250 u 1, iptg 80

15、 u 1, xgel 320 u 1（19）质粒快检 挑取平板上的白色菌落另取平板培养。 在1.5ml ep管中各加入40u 1快检液i（50ul 1 ommol/edtaph8.0） 用枪头刮取菌体于ep管中，充分震荡 各加入20ml快检液ii 65°c烘箱15min 加入10»1快检液iii （酸酚）充分震荡，12000rpm5min 取上清5ul点样电泳3、结果与数据分析（1）初筛方法所得出结论：在反硝化微生物的厌氧培养涂布平板中，样本稀释倍数以10'与10刁浓度最为合适，此时菌落数从10个 到50个不等。一周后长出菌落直径12mm,两周后长出的菌 落直径为3

16、4mm,菌落形态十分容易辨别。（2）复筛结果：共挑取有代表性的十株菌株接种至加giltay培养基 与btb的大试管中，一星期后，十个试管中有八个变色，记录 其编号。在平板a上观察变色的八个菌落形态，得出以下数据:表一：菌落形态编号大小形状边缘厚度颜色透明度17a大不规则光滑较薄黄半透明17b小圆形光滑较厚黄半透明19a大不规则光滑较厚黄半透明19b大不规则光滑较厚黄半透明23a大不规则粗糙较薄白半透明38b大不规则光滑较厚黄半透明41a小不规则粗糙较薄白不透明43a大不规则粗糙较厚白不透明（3）使用紫外分光光度仪进行硝酸盐降解程度的测定，紫外光波长 为220nm和275nm，此时已培养两周时间

17、。以菌落形态有代表 性为标准，测定了 8个菌株中的5个，得出以下数据：表二：8个菌株中5株的吸光度实测值吸光度实测值a220a275a 校正(a220-2a275)原液0.3870.0080.37117a0.3530.0910.17117b0.3300.1640.00219a0.4190.1220.17519b0.4900.1210.24823a0.3520.1460.060对获得的吸光度数据进行处理，得到表三:表三：5株菌株的降解率编号原浓度(mg/1)降解率原液167.2817a38.0577.25%17b-0.48100.28%19a38.9676.71%19b55.6066.76%23

18、a12.7592.38%分析比较实验数据，发现17b, 17a, 23a三株菌株的反硝化能力最 强。同时发现17b的实验数据存在负值，说明实验存在误差。(4) 关于以16s rdna基因pcr反应条件的改进：在实验过程中，为了找到扩增菌株样品16s rdna的最适条件，使用 温差梯度 pcr 仪，设置 51°c、53°c、55°c、5丁c、59°c、61°c六个 梯度为退火温度，电泳后得出以下结果：marker 57°c 55°c 61°c 59°c 57°c 55°c 53°

19、;c 51°c发现当退火温度为55°c到57°c时pcr效果最好,因为此时条带较亮, 说明dna浓度较高，而61°c明显太高。最终确定16s rdna的pcr 反应条件为：94°c for 2min, 30 x (94°c for 30s, 55 °c for lmin, 72°c for lmin) ,72°c for 10 min, 15 °c fore ver o(5) 凝胶电泳结果说明：为了简便标记，将原有菌株重新编号，17a、17b、19a、19b、23a、38b、41a和应更改为1、

20、2、3、4、5、6、7号菌株nirs与nosz基因鉴定结果该实验重复四次，第一次pcr扩增失败，第二次出现较多非特异条带。分析实验过程屮可能出现的问题，对pcr的反应体系作出修改，见“实验材料和方法(7)修止pcr体系”。第三次与第四 次结果和同如图所示。nosz 阳性 7654321 nirs 阳性 7654321图片中marker左边为以nosz基因为0的基因的pcr产物的电泳情 况，marker右边为以nirs基因为冃的基因的pcr产物的电泳情况， 与相应阳性对照比较得出结论：第1、3、4号菌株含有nosz基因， 但没有菌株含有nirs基因。16s rdna的电泳结果，如图：marker

21、 7654321.5kb 16s rdna的pcr扩增完成后，进行割胶回收，为了为化学转 化做准备，对割胶回收产物dna进行电泳，观察其浓度是否 足够。如图所示，5、6、7号菌株回收dn a浓度较低，在化 学转化时用上全部dna冋收产物。marker 1234567 marker 化学转化完成后，在培养16小时的amp的lb平板上挑取白色菌落每个菌株各6个菌落，接种到新的amp的lb平板上继续培养，12小时候挑取菌落做快检，同时把菌液加40%甘油放入菌种管中-40°c保存。快检结果显示仍有少量空质粒存在，丢 弃相应菌种管。此图显示，左起第5、7、9列为空质粒。因为空质粒为极个别 现象

22、，在此仅显示全部快检结果的一部分。(6) 菌种鉴定结果每株菌株送3管菌液至公司测序，公司为上海英俊生物技术有 限公司。对7株菌株样品的16s rdna测序结果与基因库相比对，得到表四:表四：菌种鉴定结果菌株编号最相似菌种相似度1-17aaeromonas hydrophila99%217baeromonas hydrophila99%3 ->19aaeromonas media98%4->19baeromonas media99%5-23aserratia fonticola99%acinetobacter sp.99%6-38baeromonas media99%7 ->41aserratia fonticola99%其中，共分离得到三种细菌，嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila )、中间气单胞菌(aeromonas media )、居泉沙雷氏菌 (serratia fonticola)o值得注意的是，5号菌株2个克隆鉴定为居泉 沙雷氏菌，但另一个克隆鉴定为不动杆菌属的某种jacbietobacter ¥.),由于此属细菌在自然环境中分布极广，且粘附性强，疑似为菌 种管被外源菌污染所致。4、分析总结与讨论本课题较成功地分离出8株反硝化菌株。分析比较实验数据，菌 株17b, 17a, 23a的反硝化能力最强。屯泳的结果显示，菌株17