冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究(精)

1、冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究作者：赵智刚，唐晓琼，黎纬明，游泳，邹萍【摘要】 为了了解冻存复苏过程对骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stemcell ，MSC) 生物学特性和支持造血能力的影响，采用常规方法分离培养 骨髓 MSC 将传代后的细胞用含 10%二甲亚砜、40%胎牛血清的 IMDM 细胞冻存 液保存在-196C液氮中，观察短期(4 周)和中期(9-15 月)复苏后 MSC 勺活 性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同冻存前的MSC 进行比较。结果表明：中短期冻存后的 MSC 勺细胞活性分别为(90 士 3.75) %和(93 士 2.51

2、) %；冻存后细胞的增殖能力、免疫表型、体外分化为脂肪和骨细胞的 能力、支持集落(CFU-GM CFU-E CFU-GEMM 的生长作用和冻存前 MSC 相似。 结论：骨髓 MSC 在液氮中短期和中期保存后，细胞活性略有下降，但是并不影 响 MSC 勺增殖、分化和支持造血能力。【关键词】 支持造血 Biological Characteristics and Ability of SupportingHematopoiesis of Bone Marrow MesenchymalStem Cells Pre-and Post-Cryop-reservationAbstract Thisstud

3、y was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bonemarrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitrohematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196 C liquid n itroge n for4 weeks (short term)and 9-15 months (medium term) with IMDM

4、containing 10% DMSO ， 40% fetal calfserum as cryoprotectant.The viability， proliferation ，immunophenotype， in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis ofthawed MSC were investigated and compared with these of pre-cryopreservedMSC.The results showed that the cell viability were (

5、93 士 2.51) % and (90 士 3.75) % forMSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However ， therewere no changes detected ， as compared with pre-cryopreserved MSC inimmunophenotype ，abilities of proliferation and supporting colony forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded

6、 that bone marrow-derived MSC can be storedin liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) withoutchanges of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support.Key wordscryopreservation; mesenchymal stem cell ； hematopoiesis support 间充质干细胞(mesenchymal stem

7、cell , MSC 具有多向分化和支持造血的能 力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良 好的治疗效果1-4 。将培养后的 MS(冻存，在患者需要 MSC 台疗时给予输 注，具有很好的临床应用前景。但是，冻存是否会影响MSC 勺生物学特征，我们尚不清楚。因此，本研究将骨髓来源的MSCM存于-196C液氮中，观察中期和短期冻存后 MSC 勺增殖、分化和支持造血的能力并同冻存前的MSC行比较，为进一步在临床中的应用提供详尽的实验依据。材料和方法 试剂 IMDM DMEMDF12 MCD 培养液、胎牛血清、马血清和甲基纤维素均为 Gibco 公司产品。鼠抗人 CD11b

8、 CD29 CD31 CD34 CD44 CD45 CD105 和HLA-DR%体购自 PharMingen 公司；rh-SCF、GM-CSF EPO IL-3 购自 Peprotech 公司;胰酶 EDTA 全反式维甲酸1-甲基-3- 异丁基-黄嘌呤（IBMX 和二甲亚砜（DMSO 购自 Sigma 公司。MSC 勺分离和培养骨髓来自 8 例健康志愿者（年龄 18-34 岁，平均 29 岁）。髂后上棘抽取骨髓， 用淋巴细胞分离液（密度 1.077 ） 400Xg 离心 20 分钟，取白环以上细胞部 分，计数后接种于含 40% MCDB2% FCS 勺 DF12 培养液中，置 37C、5% C

9、O2 培 养箱中培养， 24小时后换液，去除未贴壁细胞。当细胞达到 70%融合时，常规 消化传代。MSC 勺冻存和复苏将 1X106 细胞加入含 10% DMSO 和40% FCS 勺 IMDM 中，总体积 1.8 ml。先置于-80C冰箱中，第二天转入-196C中冻存。将中期 9-15 个月（平均 13 个月）和短期（4 周）冻存的 MSCS于 37C水浴中快速复温， 冻融后加入 8 ml IMDM 混匀后离心， 然后再用 IMDM 洗涤 1 次， 置于 37C、 5% CO2培养箱中培养。第 2 天，更换新鲜培养液。细胞活性和增殖能力测定应用台盼蓝拒染回收率（TBR 试验检测复苏细胞的活性

10、，TBR（%冻存后活细胞计数/冻存前活细胞计数X台盼蓝拒染率X100%。将冻存前后的 MSC 接种在 24 孔板中（5X103 细胞/孔），置 37C、 5% CO2 培养箱中培养，每隔 1 天取 2 孔细胞进行计数，计算均值，绘制生长曲 线。 细胞免疫表型分析用含 20 g/L BSA 的 PBS 将胰酶消化后的 MSC制成 1X106 cells/ml 的细胞悬液。每个上机试管中加入 500 卩 l 细胞悬液， 先加入鼠抗人 CD11b CD29 CD31 CD34 CD44 CD45 CD105 和 HLA-DF 单克 隆抗体，同时设空白对照，于 4C孵育 30 分钟，PBS 洗 3 遍

11、。再加入 FITC 标记 的羊抗鼠 IgG，4C孵育 30 分钟，PBS 洗 4 遍，用流式细胞仪检测。使用 cellquest 软件获取并分析数据。体外诱导多向分化检测成骨诱导将 5X104 细胞接种于 6 孔板中，加入含 10-7mol/L 地塞米松、10 mol/LB磷 酸甘油、0.05 mol/L 维生素 C 和 10% FCS 勺 IMDM 3 周后应用 von Kossa 染色 检测钙化小结。脂肪诱导 将 5X104 细胞接种于 6 孔板中，加入含 10-6mol/L 地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L 维生素 C 和 10% FCS 的 IMDM 7 天

12、后油红 O 染色检测脂肪滴。支持造血的能力测定将冻存前后的骨髓 MSC 用 10.0 Gy 60Co 丫线照射，然后更换为长期培养液（含 12.5 %FCS 12.5%马血清、2 mmol/L 谷氨酰胺、10-6 mol/L 氢化考的松的 IMDM。 获取健康人骨髓单个核细胞，预先培养 4 小时以去除贴壁细胞，将悬浮细胞按 照 1X106/ml 接种在照射后的 MSC 中，在 37C、5% CO2 条件下培养，每周半量 换液。 4 周后获取全部细胞接种于甲基纤维素体系中测定其集落形成能力。 培 养体系为：IMDM 中含 30%血清、1% BSA 2 mmol/L 谷氨酰胺、1X10-4/LB2

13、 巯基乙醇、1%甲基纤维素和重组细胞因子。细胞因子包括：rhSCF 50 ng/ml，IL-310 ng/ml ，GM-CSF 50 ng/ml 和 EPO 4 U/ml。集落形成实验在 24 孔培养板中进行，于 37C、5% CO2 条件下培养 14 天。每孔接种 1X106 个细 胞。 14 天后在倒置显微镜下计数集落， 50 个以上细胞为 1 个集落。统计学分析 采用 SPSS 11.0 软件进行统计分析，实验数据用 平均值标准误表示，组间比较应用方差分析。结 果 骨髓 MSC 勺形态特征和生长特点于倒置显微镜下，冻存前骨髓 MSC 为成纤维样，胞浆丰富，核染色质细，核仁明显，平行排 列

14、或旋涡样生长。根据细胞生长曲线，骨髓 MSC 勺倍增时间约为 42.03 士 2.41 小时。细胞形态和倍增时间随着细胞传代并不发生改变。冻存后 MSC 勺活性率和增殖能力骨髓 MSC 的活性率（TBR 随着冻存时间的延长略有下降。短期冻存 MSC 的 TBR 为 93 士 2.51 %;中期冻存 MSC 的 TBR 为 90 士 3.75 %。二者之间并没有显著性差异。 冻存后 MSC 的增殖能力同冻存前相比 较， 没有明显差异。依据生长曲线可以得出短期和中期冻存后骨髓MSC 的倍增时间分别为 39.54 士 3.53 小时和 41.64 士 1.68 小时。冻存前后 MSC 的免疫表型通过

15、流式细胞仪检测冻存前后骨髓 MSC 的免疫表型发现，冻存前后MSC 均表达 CD29 CD44 CD105 而 CD11b CD31 CD34 CD45 和 HLA-DR 均为 阴性（表 1）。CD 分子的表达量在冻存前后略有不同，但均不存在显著性差异。Table 1.Flow-cytometric phenotype analysis of adult bone marrow derived MSC beforeand after cryopreservation（略） 多系分化的鉴定 成骨分化 2 周后细胞聚集成集落，并有少量钙盐沉积，继续培养 1 周，细胞呈现多层生长的结节状，并有大量钙

16、盐沉积，而对照组细胞仍为单层 生长，无钙盐沉积。vonKossa 染色证实为钙盐沉积（图 A），对照组无上述现 象出现。成脂肪分化 3-5 天后发现少量细胞中有小脂肪滴出现，继续诱导，1 周后可以看见大部分细胞胞体变大，胞浆出现大量脂肪滴，油红0 染色证实为脂肪滴（图 B），而对照组细胞胞浆中无脂肪滴出现，油红 O 染色为阴性。冻存后的 MSC 同样具有成骨和成脂肪分化能力（图 C, D）。 支持 造血作用为了评估冻存是否影响 MSC 支持造血的能力，将骨髓单个核细胞接种于照射过的冻存前和复苏的 MSC 中，在长期骨髓培养液中培养 4 周后检测 CFU生成情况。如表 2 所示，冻存前后 MS（

17、均具有支持造血作用。CFU-GM CFU-E 和CFU-GEM 的产率在以冻存前、短期冻存和中期冻存后 MSC 为滋养层的 骨髓长期培养体系中并无显著性差异。 Table 2.Hematopoiesis supported by MSC in long term bonemarrow culture （略）讨论MS（是造血微环境中主要组成部分，通过合成、分泌多种造血因子和黏附分子来调控造血干 细胞的增殖、分化和自我更新。既往研究显示，MS（可以合成并分泌多种造血细胞生长因子，具有维持长期培养起始细胞 （LTC-IC） 的能力，促进造血干细胞 的增殖和分化5。联合 MSC 勺移植方案还可以促进

18、HSC 的植入和移植后的造 血恢复6。但是，在体外培养扩增中，MSC 勺增殖能力会逐渐下降并发生分 化，支持造血的能力减弱。将扩增后或者增殖旺盛的MSC4行冻存，在需要的时候复苏培养，可以有效地解放上述问题并确保提供足够的MSC 应用于临床。既往的大量研究显示，造血干细胞可以在液氮中长期冻存，复苏后仍 然具有良好的造血重建能力。但是，MSC 经过低温冻存和复苏，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影响，尚不明确。因此，我们观察了骨髓MSC 经过短期（ 4 周）和中期（ 9-15 月）冻存后的生物学特性和支持造血能力。结果显 示，经过中期和短期冻存后 MSC 勺形态并未发生改变，仍为梭形，贴附在

19、培养 瓶底。冻存后 MSC 的活性略有下降，但冻存并不影响细胞的增殖能力，冻存前 和中期、短期冻存后 MSC 勺倍增时间在 40 小时左右，经统计学分析不具有显著 性差异。通过 FACS 检测，冻存前后的 MSC 的免疫表型没有明显改变，表现为 CD29 CD44 和 CD105 为阳性，而 CD11b CD34 CD31 CD45 和 HLA-DR 为阴 性。多向分化能力是 MSC 勺主要特征之一，我们将经过中期和短期冻存后MSC诱导向脂肪和骨分化，结果显示冻存后 MSC 仍然具有向脂肪和骨分化的能力， 而且这种分化能力，并不随着复苏后细胞的传代而发生变化。由此可见，中期 和短期冻存并不影响

20、 MSC 的生物学特性。支持造血是骨髓 MSC 的重要功能之一，冻存后 MSC 支持造血能力是否 发生变化将直接影响 MSC 的临床应用。Majumdar 等7的研究显示，骨髓 MSC 可以分泌多种造血生长因子，具有支持造血作用，能促进骨髓来源的CFU-GM，CFU-E CFU-Meg口 CFU-GEMM 增殖。但是冻存后 MSC 支持造血能力如何变 化，既往并无报道。在本实验中，我们通过检测体外长期培养体系中集落形成 情况来评估冻存后 MSCM造血干细胞的支持作用。骨髓单个核细胞在以冻存 前、短期冻存和中期冻存后 MSC 乍为滋养层的骨髓长期培养体系中培养，4 周 后的骨髓单个核细胞的 CF

21、U生成率在各体系之间没有显著性差别。这说明经过 中期和短期冻存后 MSC 仍具有支持造血能力，同冻存前比较，支持造血能力没 有明显变化。进一步分析上述不同培养体系中CFU-GM CFU-E 和 CFU-GEM 的生成情况，结果表明：冻存前后 MSC 均可以促进 CFU-GM CFU-E 和 CFU-GEM 的增 殖，而且 MSCS进定向祖细胞的增殖能力在冻存前后没有明显差别。这些结果 表明，冻存并不影响 MSC 促进不同阶段造血祖细胞增殖、分化的能力。综上所述，本研究通过体外实验初步证实：经过中期和短期低温冻存 的骨髓MSC 并不改变其固有的生物学特性。虽然冻存可以导致部分细胞损伤， 但是并不

22、影响剩余细胞的增殖能力和多向分化能力。此外，冻存后的MSC 仍然具有支持造血的功能。但是，冻存后MSC 是否在体内仍具有上述生物学性状和支持造血功能， 尚需进一步研究证实。 【参考文献】 1Jiang Y ， Jahagirdar BN ， ReinhardtRL ， et al.Pluripotency of me-senchymal stem cell derived from adult marrow.Nature ，2002; 418 (6893): 41-49 2Krause DS，Theise ND，Collector MI ，et al.Multi-organ ，multi-li

23、neage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.Cell， 2001;105:369-3773Noort WA，Kruisselbrink AB，int-Anker PS，etal.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cordblood-derived CD34 ( ) cells in NOD/SCID mice.Exp Hematol ， 2002; 30: 870-8784Koc ON， Gerson SL， Cooper BW， et al.Rapid hematopo