基因操作的主要技术原理

1、第三章第三章 基因操作的主要技术原理基因操作的主要技术原理第一节第一节 核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化n核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的 n真核生物95%DNA存在于细胞核内，5%在细胞器 n75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15%在细胞器 nrRNA（8085%），tRNA及核内小分子RNA（1015%），mRNA（15%）一、核酸分离提取的原则一、核酸分离提取的原则1. 保证核酸一级结构的完整性保证核酸一级结构的完整性 2. 排除其它分子的污染排除其它分子的污染 n核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子n将其它生物大分

2、子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低 n排除其它核酸分子的污染 核酸提取的基本要求核酸提取的基本要求 n尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏 n减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱） n减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、高温） n防止核酸的生物降解 提取核酸的一般程序提取核酸的一般程序: 破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质及多糖等 去除其它核酸分子 沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化核酸 核酸的质量评估（电泳、D260/OD280，酶切） 二、质粒二、质粒载体的分离与纯化载体的分离与纯化 关键：关键：如何使质粒如何使质粒DNA与宿主染色体与宿主染色体DNA

3、分开分开 依据：依据：质粒质粒DNA比染色体比染色体DNA小得多，小得多，在在DNA提取过程中，染色体提取过程中，染色体DNA断裂断裂成片段成片段(线状线状)，而质粒，而质粒DNA仍保持超仍保持超螺旋构型螺旋构型 变性法提取质粒变性法提取质粒DNA的原理的原理 在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。 当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。碱变性法提取质粒碱

4、变性法提取质粒DNA的步骤的步骤收集细胞沉淀加入溶液I (50mM 葡萄糖, 25mMTris-HCl, 10mM EDTA, 45mg/mL 溶菌酶）加入溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS)加入溶液III (3M NaAc pH4.8)离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白质乙醇沉淀收集质粒DNA在强碱性环境中暴露时间过长，cccDNA可发生不可逆变性关键：关键：尽可能地保持其高分子量尽可能地保持其高分子量细菌细菌 33004200kb 酵母酵母 15,000 kb果蝇果蝇 1.65x105 kb 人人 3x106 kb植物植物 2x1051x108 kb 天花病毒天

5、花病毒 288 kb痘病毒痘病毒 196 kb三、染色体三、染色体DNA的分离纯化的分离纯化CsCl密度梯度离心密度梯度离心原理：原理：nCsCl介质密度为1.7g/cm3，超速离心后形成11.9052 g/cm3的密度梯度nEB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱基对之间，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应n线性或开环DNA分子，因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的EB直到达到饱和n具有ccc结构的质粒DNA由于负超螺旋的存在阻止DNA解链，因而只能结合很少的EBnDNA分子中结合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以区分 质粒质粒质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化氯化

6、铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法： 用含有用含有EDTA的缓冲液的缓冲液悬浮菌体悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞加溶菌酶裂解细菌细胞壁壁 加加CsCl和溴乙锭和溴乙锭超速离心过超速离心过夜夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs 关键：关键： 防止内外源防止内外源RNase的作用的作用 四、四、RNA的分离与纯化的分离与纯化RNase的特点：n抗酸抗碱,具很广pH作用范围n抗高温严寒(065均具活性，100也不能使之完全失活）n抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）n酶活性不需要辅助

7、因子n存在范围广 解决办法：解决办法：外源RNase：高温（干热180，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套 内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等 五、五、核酸的浓缩与贮存核酸的浓缩与贮存 n沉淀沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸n沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10体积的3M NaAc（或KAc）和2倍体积的乙醇，放置1530min，离心收集DNA沉淀，倒去上清液

8、，加入70%的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐，再离心收集沉淀。 贮存贮存nDNA：溶于TE中，放置于4、-20、-70nRNA： 溶于0.3M NaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70 长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20 六、核酸的质量评估方法六、核酸的质量评估方法 n核酸浓度的测定核酸浓度的测定 ds-DNA：1 OD26050g/ml ss-DNA&RNA：1 OD26040g/ml 单链寡核苷酸：单链寡核苷酸：1 OD26020g/ml n核酸纯度的测定核酸纯度的测定 DNA：A260/A280=1.8 若1.8，说明RNA未除尽 1.6，蛋白质或酚未除尽RNA：A260/

9、A280=2.0 2.0，蛋白质或酚未除尽 第二节第二节 凝胶电泳凝胶电泳一、核酸电泳的基本原理一、核酸电泳的基本原理 核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分子分离，分子量小的DNA，具有较紧密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力片段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分辨分辨DNADNA片段的大小范围（片段的大小范围（bpbp） 0.3%琼脂糖琼脂糖 500001000 0.7%琼脂糖琼脂糖 200001000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6000

10、300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1000 100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 500 25 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50 1 DNARNADNA蛋白质蛋白质核酸电泳的染色剂和指示剂核酸电泳的染色剂和指示剂 n指示剂指示剂 在电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程 琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度 0.6% 1% 1.4% 2%溴酚蓝溴酚蓝 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb二甲苯青蓝二甲苯青蓝 2kb 1.6kb n染色剂染色剂 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）：嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外光下呈现橙色荧光 由于单链DNA、RNA中常存在自身配对的双链

11、区，也可嵌入EB分子 EB是一种诱变剂，见光易分解n在常规电泳中，DNA移动距离与分子量有关：分子量小的移动快，反之则慢n大于20kb的DNA大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些DNA分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。 三、脉冲场凝胶电泳三、脉冲场凝胶电泳n 在脉冲场凝胶电泳中，加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的DNA分子用于改变泳动方向的时间不同，则可以得到分离脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE PFGE工作原理

12、工作原理nDNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr） nDNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm） n电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp） n分子量大的DNA分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。n由于脉冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间则随分子量大小而变化。n分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。nTp小小 = Tm小小+ Tr小小 Tp大大 = Tm大大+ Tr大大 nTp小小 = Tp大大 nTr小小 Tm大大 ，所以，所以， S小小 S大大 n显然，要

13、使一个显然，要使一个DNA样品中不同大小的样品中不同大小的DNA分子分离，脉冲时间应选在最大分子分离，脉冲时间应选在最大DNA分子所需分子所需的上限。的上限。 第三节第三节 DNA序列分析序列分析 1. 双脱氧核苷酸链终止法双脱氧核苷酸链终止法 Dideoxy-termination sequencing Sanger法基本原理：基本原理： 双脱氧（双脱氧（2，3）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因链中，但因3 端不具端不具OH基，基，DNA链合链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA

14、分子中掺入的位置不同，故可根据分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列片段测定出核苷酸序列过程过程：制备ss-DNA与引物退火分为4个反应系统每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸DNA聚合酶定序反应反应产物变性后电泳凝胶干燥放射自显影 DNA Sequencing ReactionsThe DNA sequencing run is similar to the PCR run.The run mix includes the template DNA, Taq polymerase, dNTPs, ddNTPs, and

15、a primer: a small piece of single-stranded DNA 20-30 nt long that hybridizes to one strand of the template DNA.The run is intitiated by heating until the two strands of DNA separate, then the primers anneals to the complementary template strand, and DNA polymerase elongates the primer. 4 different D

16、NA synthesis reactions are run begin synthesis from specific priming point add components for DNA synthesis + specific ddNTP for each of the four reactionse.g. ddATPNo 3OH.ddCTPACCCTTGGMethod from Saenger Manual sequencing uses radiolabeled dATP (35-S or 33-P) to label the DNA. The sample is then sp

17、lit into four tubes each with an individual ddNTP present. The samples are then subjected to acrylamide gel electrophoresis followed by autoradiography.nDNA全自动测序全自动测序Putting It All TogetherUsing gel electrophoresis to separate each DNA fragment that differs by a single nucleotide will band each fluo

18、rescently tagged terminating ddNTP producing a sequencing read.The gel is read from the bottom up, from 5 to 3, from smallest to largest DNA fragment. 屏幕显示的胶图Raw Automated Sequencing DataA 5 lane example of raw automated sequencing data.Green:ddATPRed:ddTTPYellow: ddGTPBlue:ddCTPSanger：荧光检测 377测序仪人类

19、基因组计划测序的主力机型测序的主要设备上样走电泳编写样品清单全自动的测序仪器：MegaBace 华大基因研究中心华大基因研究中心(北京北京) 承担了人类承担了人类3号染色体短臂上的约号染色体短臂上的约3000万对碱基的万对碱基的测序任务，使中国成为继美、英、日、德、法之后第六个测序任务，使中国成为继美、英、日、德、法之后第六个加入加入国际测序俱乐部国际测序俱乐部的国家。的国家。中心已建成了基因组学、蛋中心已建成了基因组学、蛋白质组学、生物信息学研究及产业化平台，拥有白质组学、生物信息学研究及产业化平台，拥有ABI 377-96 平平板测序仪板测序仪11台，台，MegaBACE1000 毛细管测

20、序仪毛细管测序仪70台台 。 TADA!2001 The HGP consortium publishes its working draft in Nature (15 February), and Celera publishes its draft in Science (16 February). 2. Maxam-Gilbert化学法 原理：原理：DNA链上的不同碱基可以和链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生碱基修饰剂发生反应，然后发生12个碱基的脱落或取代，最后发生链断个碱基的脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的裂，不同位置断裂的DNA分子经凝胶分子经凝胶电泳就可

21、确定其核苷酸序列电泳就可确定其核苷酸序列 4 4种反应体系中，化学试剂特异断种反应体系中，化学试剂特异断裂裂DNADNA机制机制nG反应：反应：硫酸二甲脂使鸟嘌呤硫酸二甲脂使鸟嘌呤N7甲基化甲基化nAG反应：反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，使嘌呤环被吡啶取代键被削弱，使嘌呤环被吡啶取代nC+T反应反应：肼能裂解嘧啶环，进而导致其脱落肼能裂解嘧啶环，进而导致其脱落nC反应：反应：在一定浓度的在一定浓度的NaCl条件下，肼只对胞嘧条件下，肼只对胞嘧啶起作用啶起作用反反应应 断断裂裂位位置置 碱碱基基修修饰饰 修修饰饰碱碱基基 的的转转移移 DNA链链

22、的的 断断裂裂 R1 G 硫硫酸酸二二甲甲酯酯 六六氢氢吡吡啶啶 六六氢氢吡吡啶啶 R2 G+A 酸酸 酸酸 六六氢氢吡吡啶啶 R3 C+T 肼肼 六六氢氢吡吡啶啶 六六氢氢吡吡啶啶 R4 C 肼肼+盐盐 六六氢氢吡吡啶啶 六六氢氢吡吡啶啶 n化学法测序的一大优点是不需要模化学法测序的一大优点是不需要模板，引物和板，引物和DNA聚合酶。待测聚合酶。待测DNA链的检测用链的检测用32P末端标记末端标记 作作 业业 A solution contains double-stranded DNA fragments of size 3 kb,6 kb, 9 kb, and 12 kb. They a

23、re separated in an electrophoresis gel. In the diagram of the gel at the right, match the fragment sizes with the correct bands. A cloned fragment of DNA was sequenced by using the dideoxy method. A part of the autoradiogram of the sequencing gel is represented herenDeduce the nucleotide sequence of

24、 the DNA nucleotide chain synthesized from the primer. Label the 5 and 3 endsnDeduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain used as the template strand. Label the 5 and 3 endsnWrite the nucleotide sequence of the DNA double helix (label the 5 and 3 ends)第四节第四节 分子杂交技术分子杂交技术核酸杂交nSouthern

25、印迹杂交 （Southern blotting ）nNorthern 印迹杂交（Northern blotting ）nWestern 印迹杂交（Western blotting ） Southern杂交杂交 Southern杂交是指以杂交是指以Southern名字命名的名字命名的DNA转移杂交技术，用于特定转移杂交技术，用于特定DNA序列的检测，包序列的检测，包括基因组特定括基因组特定DNA序列的定位，相关片段的同源性测序列的定位，相关片段的同源性测定、从定、从cDNA库、基因组文库中筛选目的基因等。用库、基因组文库中筛选目的基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组一种或多种限制性内切酶对基

26、因组DNA加以切割，通加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。中一类重要的检测手段。Southern 印迹杂交的用途n确定在克隆片段中基因编码区的大小和位置n确定克隆片段在基因组中的拷贝数Southern blottingSouthern

27、blottingNorthern Blottingn相对相对Southern blotting命名的，与命名的，与Southern blotting不同的是，它检不同的是，它检测的对象是测的对象是RNA分子。分子。 Western Blottingn杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从从SDS-PAGE中转移到一固相支持中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检测应进行检测 n主要用于基因的表达产物蛋白质的检测 第五节第五节 PCR技术技术一、一、PCR技术的基本原

28、理技术的基本原理 Polymerase chain reaction, PCR 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 A method for amplifying specific DNA segments that exploits certain features of DNA replication.n一个一个DNA经经n次扩增后次扩增后, 一个一个DNA分子分子可变为可变为2n 理论上经过理论上经过30次循环，靶次循环，靶DNA得到得到109倍的扩增，实际是倍的扩增，实际是1067倍的扩增倍的扩增nDNA扩增需要对待扩增的扩增需要对待扩增的DNA序列有序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序所

29、了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物列为已知，以便合成寡核苷酸引物 二、二、PCR反应的各种组份及作用反应的各种组份及作用 一个标准的一个标准的PCR反应体系（反应体系（50100 l） n 50 mmol/L KCln 10 mmol/L Tris-HCl（pH=8.4）n 1.5 mmol/L MgCl2n 100 g/ml 明胶或牛血清白蛋白（BSA）n 2个引物，各0.25 mol/Ln dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP） 各200mol/Ln 模板DNA（人基因组DNA） 0.11gn Taq DNA聚合酶 2 UnDenaturation 9

30、4 , 0.5minnPrimer annealing 55 , 1.5mionnExtension 72 , 1min 30 cycles 变性（模板）退火（引物与模板）延伸（新合成DNA链）1. 模板模板DNAn用于用于PCR扩增的模板扩增的模板DNA通常是从细胞中通常是从细胞中提取的染色体提取的染色体DNA，它们并不需要高度纯，它们并不需要高度纯化。化。n待扩增的靶待扩增的靶DNA的长度在的长度在3kb以下是以下是PCR的有效扩增范围，的有效扩增范围，采用经改造的采用经改造的Taq DNA聚合酶可扩增出聚合酶可扩增出40 kb的的DNA 片段片段。 2. 引物引物nPCR引物是与待扩增的

31、目的引物是与待扩增的目的DNA两端序列两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段互补的人工合成的寡核苷酸片段n引物的长度通常为引物的长度通常为1730个核苷酸个核苷酸 引物太短，可能同非靶DNA杂交，得出非预期的扩增产物； 引物太长，引物与模板的结合效率降低，影响扩增效率。 v如8nt的引物，平均每48=65536 bp就会有一个结合位点，在全长为3109 bp的人类基因组中，大约有43000个可能的结合位点，不能得到单一的特异性扩增产物。v如为17nt的引物，出现几率为417=17,179,869,184 bp，长度超过人类基因组长度的5倍，故在人类基因组中只可能有一个结合位点。 v但引物不是越长

32、越好，过长的引物同模板DNA的杂交效率反而下降，从而降低PCR反应的效率。 n简并引物简并引物 是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间只有一个或数个核苷酸的差异。如根据氨基酸序列推测出的核苷酸序列。 n引物与复性温度引物与复性温度 v引物与模板结合的特异性与复性温度有密切引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系关系 当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱基，导致一些不需要的配碱基，导致一些不需要的DNA片段被扩增片段被扩增 复性温度过高，引物与模板不能配对复性温度过高，引物与模板不能配对v复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接复性温度常与引物的长

33、度和碱基组成有直接关系，引物越长或关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些可以高些，反之则低些 Tm=4(GC)2(AT) 12 belown引物设计的一般原则引物设计的一般原则: Correspond with the sequences flanking the target region on the template molecule. v引物的长度常为1730vGC含量为40%60%vTm值高于55 v两条引物间配对碱基数小于5个v引物自身配对(特别是在引物的3端)形成的茎环结构, 茎的碱基配对数不大于3 通常采用计算机辅助设计通常采用计算机辅

34、助设计3. dNTP n浓度为20200mol/L，4种dNTP以等摩尔浓度配制 n浓度过高，加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入率和成本 n浓度过低，反应速度下降，提高实验的精确性 4. Taq DNA聚合酶聚合酶 基本特点基本特点: Taq DNA聚合酶是从一种极度聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得中分离纯化而得n具有DNA聚合酶活性、53外切酶活性、逆转录酶活性n最适反应温度为80n最适pH8.0和最佳反缓冲液TrisHCl n最佳二价阳离子Mg2+ （10 mM）n具良好的热稳定性：在90下连续反应30分钟仍有70%的酶活 扩增产物的可靠性扩增产物的可

35、靠性:v评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率v天然复制的DNA分子中错误掺入率为10-9v在体外实验中，Klenow片段的错误掺入率为10-4，Taq DNA聚合酶的错误掺入率为510-3 ，而T4聚合酶的错误掺入率为10-7v在克隆基因时，应采用高保真的在克隆基因时，应采用高保真的Taq DNA聚合酶（聚合酶（Pfu）（）（3-5 exonuclease) 5. PCR反应的平台期反应的平台期 反应底物和产物在反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，出现平台最终将会导致聚合反应进入平台期，出现平台期的

36、原因可能有：期的原因可能有：后期循环酶浓度或聚合时间不足；后期循环酶浓度或聚合时间不足；引物耗尽；引物耗尽；dNTP耗尽；耗尽；产物浓度过高，以致产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退解链后又迅速退火，不能与引物结合。火，不能与引物结合。三、PCR产物的鉴定nGel electrophoresis of PCR productsnCloning of PCR productsnSequencing of PCR productsCloning PCR productsnTaq DNA polymerase tends to add an additional nucleotide, us

37、ually A, to the end of each strand it synthesizes. nDesign primers that contain restriction sites第六节第六节 DNA芯片技术芯片技术DNA芯片或微阵列技术(DNA chip or microarray)nDNA芯片（或基因芯片）芯片（或基因芯片）是将许多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段（称为探针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，利用碱基互补配对原理进行杂交， 通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因

38、组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面基因芯片基因芯片是基因功能研究领域的一次革命基因芯片是基因功能研究领域的一次革命 n与其他的基因检测技术相比，基因芯片技术最大的特征在于能同时定量或定性地检测成千上万的基因信息n基因芯片技术具有微型化、自动化和网络化等特点，是典型的多学科高技术交叉的结晶19911991年世界第一块原位合成寡核苷酸芯年世界第一块原位合成寡核苷酸芯片在美国片在美国AffymetrixAffymetrix诞生诞生19951995年世界第一块年世界第一块cDNAcDNA芯片在斯坦福大芯片在斯坦福大学实验室诞生学实验室诞生 - Science. 1995,270: 467-470-

39、 Science. 1995,270: 467-470基因芯片的历史基因芯片的历史8080年代末期科学家提出杂交法测序的思年代末期科学家提出杂交法测序的思想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理基因芯片技术流程基因芯片技术流程 制备方法及点样仪器制备方法及点样仪器探针的制备：探针的制备：标记标记方法方法杂交：杂交：杂交液、杂交温度、杂交液、杂交温度、 洗涤条件的选择洗涤条件的选择扫描仪扫描仪:激光激光 CCD分析软件的开发分析软件的开发基因芯片的制备基因芯片的制备杂交杂交检测检测数据分析数据分析 基因芯片实验原理基因芯片实验原理一、基因芯片原理及制备方法n原位合成：寡核苷酸芯片n直接点样：寡核苷酸芯片和cDNA芯片1. 原位合成法 n在固相介质表面特定区域合成已知序列的寡核苷酸的一类技术的总称n采用光导化学合成和照相平板印刷技术合成寡核苷酸芯片2.