第六章 酶的非水相催化

1、.Chapter 6 Enzymatic catalysis in Non-aqueous system酶的非水相催化酶的非水相催化制作：崔建东制作：崔建东.Contents of chapter 61、酶催化反应的介质2、有机介质反应体系 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 GoGoGoGo5、酶非水相催化的应用 Go.1 1 酶催化反应的介质酶催化反应的介质水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物许多有机化合物(

2、底物底物)在水介质中难溶或不溶。在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保证酶催化？1984年，美国年，美国MIT的克利巴诺夫（的克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可

3、以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应溶剂的互溶体系中进行催化反应。.酶的非水相催化酶的非水相催化 o 酶的非水相催化酶的非水相催化o 酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。o 在非水相中，酶分子受到非水相介质的影响，其催化特性与在水相中催化有着较大的不同。.酶的非水相催化酶的非水相催化o 非水相酶催化的特性非水相酶催化的特性o （1 1）增加非极性基质的溶解度；）增加非极性基质的溶解度；o （2 2）使某些原本在水相不能进行的反应顺利进行，如）使某些原本在水相不能进行的反应顺利进行，如肽的合成、酯的合成等；肽的合成、酯的合成等；o （3 3）可减少在水相容易发生的副反应，如酸酐的

4、水解、）可减少在水相容易发生的副反应，如酸酐的水解、卤化物的水解等；卤化物的水解等；o （4 4）容易分离回收；）容易分离回收；o （5 5）无微生物污染；）无微生物污染；.酶的非水相催化酶的非水相催化o 非水相酶催化的相关问题非水相酶催化的相关问题o 在完全无水的情况下，酶是无活性的，极少量的水就在完全无水的情况下，酶是无活性的，极少量的水就会激发酶的活性；但含水量低于最适水量时，酶会失去会激发酶的活性；但含水量低于最适水量时，酶会失去催化活性。催化活性。o 有机溶剂可能直接与酶分子水合层中的必须水发生反有机溶剂可能直接与酶分子水合层中的必须水发生反应，影响酶的结构和功能，尤其是极性较强的溶

5、剂，它应，影响酶的结构和功能，尤其是极性较强的溶剂，它可以溶解大量的水，将酶分子水合层中的必须水剥离掉，可以溶解大量的水，将酶分子水合层中的必须水剥离掉，导致酶失活，相对来讲，疏水性溶剂对水的溶解能力较导致酶失活，相对来讲，疏水性溶剂对水的溶解能力较低，故对酶活和结构影响较小。低，故对酶活和结构影响较小。.酶的非水相催化酶的非水相催化类型类型有机介质有机介质气相介质气相介质离子介质离子介质超临界介质超临界介质.一、酶非水相催化的几种类型o 1、有机介质中的酶催化：o 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。o 特点：o 1）适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的

6、酶催化作用。o 2）酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。.一、酶非水相催化的几种类型o 1、有机介质中的酶催化o 克利巴诺夫（克利巴诺夫（KlibanovKlibanov）研究表明：）研究表明：酶在一定浓度的有机溶剂中具有一定的“分子记忆”效应，这种记忆是因为酶存在配体而产生的，当配体被移走后，由于大量有机溶剂存在状态下酶构象的高度刚性， 使得这种与配体具有高亲和性的构象得以保持，而过量水的介入会加速这种记忆丧失。o Klibanov A M. Enzyme memory-what is remembered and why? J. Natu

7、re, 1995, 374: 596-600.一、酶非水相催化的几种类型o 2、气相介质中的酶催化o 定义：气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。o 特点：o 1）适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。o 2）由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。 .一、酶非水相催化的几种类型o 3、超临界流体介质中的酶催化o 定义：超临界介质中的酶催化是指酶在超临界流体中进行的催化反应。o 条件要求：o 1）用于酶催化反应的超临界流体应当对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响；o 2）具有良好的化学稳定性，

8、对设备没有腐蚀性；o 3）超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；o 4）超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；o 5）超临界流体要容易获得，价格要便宜等。.酶非水相催化的几种类型o 4、离子液介质中的酶催化：o 离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进行的催化作用。o 离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。.一、酶非水相催化的几种类型o 4、离子液介质中的酶催化：o 常见的阳离子有季铵盐离子、咪

9、唑盐离子和吡咯盐离子等（如下图所示），阴离子有卤素离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子等.o 特点:o 不挥发、不可燃、导电性强、黏度低、热容大、蒸汽压小、性质稳定，对许多无机盐和有机物有良好的溶解性，在电化学、有机合成、催化、分离等领域被广泛的应用。 .二、酶非水相催化的几种体系o （一）、有机介质反应体系（一）、有机介质反应体系有机介质有机介质反应体系反应体系微水介质微水介质水与有机溶剂水与有机溶剂的均一体系的均一体系水与不溶有机水与不溶有机溶剂的溶剂的非均一体系非均一体系正胶束体系正胶束体系反胶束体系反胶束体系.二、酶非水相催化的几种体系o （一）、有机介质反应体系（一）、有机介质反应体

10、系o (1)微水介质体系:o 微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。o 微量的水主要是酶分子的结合水，它对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。另外有一部分水分配在有机溶剂中。o 通常所说的有机介质反应体系主要是指微水介质体系。.二、酶非水相催化的几种体系o （一）、有机介质反应体系（一）、有机介质反应体系o (2)与水溶性有机溶剂组成的均一体系：o 这种均一体系是由水和极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反应体系。o 酶和底物都是以溶解状态存在于均一体系中。由于极性大的有机溶剂对一般酶的催化活性影响较大，所以能在该反应体系的进行催化反应的

11、酶较少。.二、酶非水相催化的几种体系o （一）、有机介质反应体系（一）、有机介质反应体系o (3)与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系：o 这种体系是由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反应体系。游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。o 如果采用固定化酶，则以悬浮形式存在两相的界面。o 催化反应通常在两相的界面进行。一般适用于底物和产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催化反应。.二、酶非水相催化的几种体系o （一）、有机介质反应体系（一）、有机介质反应体系o (4)（正）胶束体系：o 胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶

12、剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。o 表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。o 反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行。.二、酶非水相催化的几种体系o （一）、有机介质反应体系（一）、有机介质反应体系o (5)反胶束体系：o 反胶束又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。o 表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。o 反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两相的界面中进行。.酶在有机介质中

13、由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性刚性”特点。因而使通过选择不同性质的溶剂来调因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。控酶的某些特性成为可能。例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性,、立体选择性和手性选择性等。由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关, , 因此在有机介质中因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。酶的稳定性得到显著提高。由于有机溶剂的存在由于有机溶剂的存在, , 水量减少，大大降低了许多需要水参与的副水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反

14、应反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程, 提高收率。提高收率。有机介质酶催化反应的优点有机介质酶催化反应的优点.三、酶非水相催化的影响因素o （二）、水对有机介质中酶的影响（二）、水对有机介质中酶的影响o (1)水对酶分子空间构象的影响：o 酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。o 维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。o 必需水与酶分子的结构和性质有密切关系。不同的酶，所要求的必需水的量差别很大。.三、酶非水相催化的影响

15、因素o （二）、水对有机介质中酶的影响（二）、水对有机介质中酶的影响o (2)水对酶催化反应速度的影响：o 有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。o 在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。o 在实际应用时应当根据实际情况，通过实验确定最适水含量。.三、酶非水相催化的影响因素o （二）、水对有机介质中酶的影响（二）、水对有机介质中酶的影响o (3)水活度： o 在有机介质中含有的水，主要有两类，一类是与酶分子紧密结合的结合水，另一类是溶解在有机溶剂中的游离水。o 研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。.三、酶非水相催化的影响因素o （二）、水对有机介

16、质中酶的影响（二）、水对有机介质中酶的影响o (3)水活度：o 水活度（water activity, Aw）是指体系中水的逸度与纯水逸度之比。通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。即：Aw = P/P0式中，P为在一定条件下体系中水的蒸汽压，Po为在相同条件下纯水的蒸汽压。o 研究表明，在一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加。o 采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。.三、酶非水相催化的影响因素o （二）、有机溶液对有机介质中酶的影响（二）、有机溶液对有机介质中酶的影响o 常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已

17、酯，二氯甲烷等。o (1)有机溶剂对酶结构与功能的影响：o 酶具有完整空间结构和活性中心才能发挥其催化功能。o 在有机溶剂中，酶分子（经过修饰后可溶于有机溶剂者除外）不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。o 有些酶在有机溶剂的作用下，其空间结构会受到某些破坏，从而使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。.三、酶非水相催化的影响因素o （二）、有机溶液对有机介质中酶的影响（二）、有机溶液对有机介质中酶的影响o (2)有机溶剂对酶分子表面结构的影响：o 酶在有机介质中与有机溶剂接触，酶分子的表面结构将有所变化。.三、酶非水相催化的影响因素o （二）、有机溶液对有机介质中酶的影响（二）、有

18、机溶液对有机介质中酶的影响o (3)有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响：o 当酶悬浮于有机溶剂中，有一部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物结合能力，从而影响酶的催化活性。.三、酶非水相催化的影响因素o （二）、有机溶液对有机介质中酶的影响（二）、有机溶液对有机介质中酶的影响o (4)有机溶剂对酶活性的影响：o 有些有机溶剂，特别是极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。o 研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。.三、酶非水相催化的影响

19、因素o （二）、有机溶液对有机介质中酶的影响（二）、有机溶液对有机介质中酶的影响o (5)有机溶剂对底物和产物分配的影响：o 有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。o 有机容剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。.四、酶非水相催化的催化特性o （三）酶在有机介质中的催化特性（三）酶在有机介质中的催化特性 o 1、底物专一性：o 在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。 o .四、酶非水相催化的催化特性o （三）酶在有机介质中的催化特性（三）酶在有机介质中的催化特性o2、对映体选

20、择性：o酶的对映体选择性又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。o酶立体选择性的强弱可以用立体选择系数（KLD）的大小来衡量。立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选择性越强。o立体选择系数与酶对L-型和D-型两种异构体的酶转换数（Kcat）和米氏常数（Km）有关。即： o式中，KLD ：立体选择系数，L: L-型异构体，D: D-型异构体，Km: 米氏常数。即酶催化反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。Kcat: 酶的转换数。是酶催化效率的一个指标。指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。.四、酶非水相催化的催化特性o （三）酶在有机介质

21、中的催化特性（三）酶在有机介质中的催化特性o 3、区域选择性o 酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性, 即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。o 酶区域选择性的强弱可以用区域选择系数Krs 的大小来衡量。区域选择系数与立体选择系数相似，只是以底物分子的区域位置1，2，代替异构体的构型L,D。即：.四、酶非水相催化的催化特性o （三）酶在有机介质中的催化特性（三）酶在有机介质中的催化特性o 4、键选择性：o 酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有化学键选择性。o 键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。.四、酶非水相催化的催化特性o （三）酶在有机介质中的催化特性（三）酶在

22、有机介质中的催化特性o 5、热稳定性：o 许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。o 酶在有机介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关。通常情况下，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降低。o 在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。.四、酶非水相催化的催化特性o （三）酶在有机介质中的催化特性（三）酶在有机介质中的催化特性o 6、pH值特性：o 在有机介质反应中，酶所处的pH 环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液 pH 值相同。这种现象称之为pH印记（pH-imprinting）或称为pH记忆。o 酶在有机介质中催化

23、反应的最适pH值通常与酶在水溶液中反应的最适pH 值接近或者相同。利用酶的这种pH印记特性，可以通过控制缓冲液中pH值的方法，达到控制有机介质中酶催化反应的最适pH值。.五、非水相催化条件控制o （四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制（四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制o 1 1、有机介质中酶催化反应的类型、有机介质中酶催化反应的类型 o 酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。o 酶在有机介质中的各种催化反应受到各种因素的影响：酶的种类和浓度、底物的种类和浓度、有机溶剂的种类，水含量、温度、pH和离子强度等。

24、.五、非水相催化条件控制o （四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制（四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制o 2 2、酶的选择、酶的选择 o 不同的酶具有不同的结构和特性，同一种酶，由于来源的不同和处理方法的不同，其特性也有所差别，所以要根据需要通过试验进行选择。o 在酶催化反应时，通常酶所作用的底物浓度远远高于酶浓度，所以酶催化反应速度随着酶浓度的升高而升高，两者成正比。.五、非水相催化条件控制o （四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制（四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制o 3 3、底物的选择和浓度控制、底物的选择和浓度控制 o 由于酶在有机介质中的底物专一性与在水溶液中的专一性有些

25、差别，所以要根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物。o 底物的浓度对酶催化反应速度有显著影响，一般说来，在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度随底物浓度的升高而增大。当底物达到一定浓度以后，再增加底物浓度，反应速度的增大幅度逐渐减少，最后趋于平衡，逐步接近最大反应速度。.五、非水相催化条件控制o （四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制（四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制o 4 4、有机溶剂的选择、有机溶剂的选择 o 有机溶剂的极性选择要适当，极性过强的溶剂，会夺取较多的酶分子表面结合水，影响酶分子的结构，并使疏水性底物的溶解度降低，从而降低酶反应速度，在一般情况下不选用； o

26、极性过弱的溶剂，虽然对酶分子必需水的夺取较少，疏水性底物在有机溶剂中的溶解度也较高，但是底物难于进入酶分子的必须水层，催化反应速度也不高。.五、非水相催化条件控制o （四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制（四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制o 5 5、水含量的控制、水含量的控制 o 有机介质中，水的含量对酶分子的空间构象和酶催化反应速度有显著影响。o 要通过试验确定反应体系的最适水含量。o 最适水含量与溶剂的极性有关，通常随溶剂极性的增大，最适水含量也增大；而达到最大反应速度的水活度却变化不大，都在0.50.6之间。o 在实际应用时应当控制反应体系的水活度在0.50.6的范围内。.五、非

27、水相催化条件控制o （四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制（四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制o 6 6、温度控制、温度控制o 温度是影响酶催化作用的主要因素之一。在最适温度下酶催化的反应速度达到最大。o 在微水有机介质中，由于水含量低，酶的热稳定性增强，所以其最适温度高于在水溶液中催化的最适温度。o 要注意的是酶与其它非酶催化剂一样，温度升高时，其立体选择性降低。.五、非水相催化条件控制o （四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制（四）有机介质中酶催化反应的条件及其控制o 7 7、pHpH值的控制值的控制o 酶在有机介质中催化的最适pH值通常与在水溶液中催化的最适pH值相同或者接近。o

28、 在有机介质中，酶的催化活性与酶在缓冲溶液中的pH值和离子强度有密切关系。o 酶分子从缓冲溶液转到有机介质后，酶分子保留了原有的pH印记。o 通过调节缓冲溶液pH和离子强度的方法对有机介质中酶催化的pH值和离子强度进行调节控制。.六、酶非水相催化应用o （五）（五）酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用o 1 1、酶在有机介质中的催化应用、酶在有机介质中的催化应用 .六、酶非水相催化应用o （五）（五）酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用o 2、手性药物的拆分o 有不少手性药物，其两种对映体的化学组成相同，但是其药理作用不同，药效也有很大差别。 o 3、手性高分子聚合物的制备o 4、酚树脂的合成

29、o 5、导电有机聚合物的合成.六、酶非水相催化应用o （五）（五）酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用o 6、发光有机聚合物的合成o 7、食品添加剂的生产o 8、生物柴油的生产o 9、多肽的合成o 10、甾体转化 .六、酶非水相催化应用o （五）（五）酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用o 生物柴油的生产o 柴油是石油化工产品，由于石油属于不可再生的能源，石油资源的短缺是世界面临的危机之一，寻求新的可再生能源已经成为世界性的重大课题。.生物柴油生物柴油生物柴油是用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类生物柴油是用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子

30、醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。 生物油脂的来源：菜子油，豆油，椰子油，棕榈油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽 油，废食用油等特特点：点：1）能达到欧洲）能达到欧洲2号排放（号排放（GB252-2000)标准；标准；2）密度比水小，相对密度在）密度比水小，相对密度在0.74240.8886之间；之间；3）稳定性好，长期保存不会变质；）稳定性好，长期保存不会变质；4）优良的环保特性：硫含量低，二氧化硫和硫化物的排放低、生物柴油的）优良的环保特性：硫含量低，二氧化硫和硫化物的排放低、

31、生物柴油的生物降解性高达生物降解性高达98%，降解速率是普通柴油的，降解速率是普通柴油的2倍，可大大减轻意外泄漏倍，可大大减轻意外泄漏时对环境的污染；生物柴油中不含对环境会造成污染的芳香族烷烃，因而时对环境的污染；生物柴油中不含对环境会造成污染的芳香族烷烃，因而废气对人体损害低于柴油；废气对人体损害低于柴油；6）较好的低温发动机启动性能；）较好的低温发动机启动性能；7) 燃烧性能好于柴油，燃烧残留物呈中性使发动机机油的使用寿命加长；燃烧性能好于柴油，燃烧残留物呈中性使发动机机油的使用寿命加长；8) 无须改动柴油机，可直接添加使用无须改动柴油机，可直接添加使用。9）含水率较高，最大可达）含水率较高，最大可达30%-45%。水分有利于降低油的黏度、提高。水分有利于降低油的黏度、提高稳定性，但降低了油的热值；稳定性，但降低了油的热值；10)pH值低，故贮存装置最好是抗酸腐蚀的材料；值低，故贮存装置最好是抗酸腐蚀的材料；11)具有具有“老化老化”倾向，加热不宜超过倾向，加热不宜超过80，宜避光、避免与空气接触保存；，宜避光、避免与空气接触保存；