细菌和链霉菌的分子克隆载体

1、第四节细菌和链霉菌的分子克隆载体细菌和链霉菌的分子克隆载体 一、革兰氏阴性菌克隆载体一、革兰氏阴性菌克隆载体 1. 移动载体（移动载体（mobilizable vector） 1) 特点特点 i. 广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围范围 ii. DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化进入中间宿主细胞可用直接转化 2) 结构结构 i. RK2质粒的结构质粒的结构 a. oriV DNA复制起点复制起点 b. DNA复制基因复制基因 c. DNA转

2、移基因转移基因 d. oriT DNA转移基因转移基因 e. 药物抗性基因（药物抗性基因（Apr Kanr Tcr）RK 2 (56 kb)TraTraKanrTraTrfA OriVTrfB rlx Tcr AmprpNJ5073(50 kb)HindIIIHindIIITrpEtmpstrTcrPstI TcrBglII EcoRI pRK290(20 kb)SalI . 移动载体与辅助质粒移动载体与辅助质粒 pRK2013: 将将RK2中的全部转移基因和中的全部转移基因和Kanr基因插入到基因插入到 E.coli的的colE1质粒中构成辅助质粒质粒中构成辅助质粒 pRK290: 余下部分

3、（余下部分（Apr除外）构成移动载体（约除外）构成移动载体（约20Kb） * 当选用当选用E.coli为中间宿主时，必须先将为中间宿主时，必须先将pRK290经过直接经过直接转化引入转化引入E.coli（pRK2013也应转入同一细胞）。当要转移也应转入同一细胞）。当要转移pRK290时，只需将时，只需将E.coli细胞与其他细胞与其他G 细胞混合，在细胞混合，在pRK2013的作用下，的作用下，pRK290可可接合转移接合转移至终宿主细胞。至终宿主细胞。 3) 不相容群不相容群（incompatibilitiy group）克隆载体）克隆载体 . P群：群：RP4 RK2 RP1 R68 2

4、-5拷贝拷贝 . Q群：群：R300B RSF1010 R1162 15-20拷贝拷贝 . W群：群：Sa 2-5拷贝拷贝 4）遗传标记基因遗传标记基因大多数为抗生素标记基因，要注意不同大多数为抗生素标记基因，要注意不同G 菌中的表达活性菌中的表达活性辅助质粒重组质粒供体细胞 受体细胞接合DNA转移G-细菌中重组质粒的转移细菌中重组质粒的转移 2. 非移动载体非移动载体(non-mobilizable vector) 1) 特点特点：不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载

5、体 2) 实例实例： P4D0105-由由E.coli噬菌体噬菌体P4构建而成，适合于构建而成，适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。和肺炎克蕾伯氏菌。 . 当辅助噬菌体提供当辅助噬菌体提供P4整合酶时，该载体可整合到整合酶时，该载体可整合到E.coli染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关。合酶无关。 . 该载体含有一个该载体含有一个virl突变和在引物酶基因突变和在引物酶基因中存在一中存在一个琥珀突变个琥珀突变(am52)，在无抑制子突变的菌株中，该载体，在无抑制子突变的菌株中，该载体不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中不能自主复制，但

6、在有抑制子突变的菌株中(琥珀抑制琥珀抑制子突变体），该载体则可自主复制。子突变体），该载体则可自主复制。XhoIKanrcosVir1P4D0105 TcrSalIP4D0105载体的结构载体的结构 二、革兰氏阳性菌（二、革兰氏阳性菌（G+）克隆载体）克隆载体 1.枯草杆菌克隆载体枯草杆菌克隆载体 1）B.subtilis作为宿主菌的优点作为宿主菌的优点 . 芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程 . 遗传背景较清楚，可直接导入外源遗传背景较清楚，可直接导入外源DNA . 非致病细菌，因而安全非致病细菌，因而安全 . 研究结果可用于其它芽孢杆菌研究结果可用于其它芽

7、孢杆菌 . 存在各种分泌蛋白质存在各种分泌蛋白质 2）B.subtilis作为宿主菌的缺点作为宿主菌的缺点 . 存在多种蛋白酶基因和相应产物存在多种蛋白酶基因和相应产物 . 外源外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应导入细胞后不稳定，易发生重组反应 3)克隆载体克隆载体 .复制子来源复制子来源 i) 质粒质粒DNA 质粒名称质粒名称 大小大小(kb) 标记基因标记基因 拷贝数拷贝数 来来 源源 pUB 4.5 Kanr 50 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 pE194 3.7 Eryr 10 同上同上 pC194 2.9 Cmlr 同上同上 pSA0501 4.1 Strr 20-50 同上

8、同上 pBC61 蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌 pLS103 B.subtilis pFTB14 淀粉液状芽孢杆菌淀粉液状芽孢杆菌 pAB124 Tcr 嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌 pTB19 25.8 Kanr Tcr 同上同上 pT181 4.4 Tcr 蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌 pCW7 同上同上 pAM1 S.faecalisii) 噬菌体噬菌体 105 39.2kb B.subtilis 温和噬菌体温和噬菌体 Q11 90kb 同上同上 SECEEEEEBgIIESKEEBgIIEcos105dcmR(26kb)105(39.2kb)Ecos 当外源当外源DNA插入上述载体时，插入

9、上述载体时，105生长的功能丧失生长的功能丧失,当重当重组组DNA分子转入已含有分子转入已含有105的溶源化菌株时，重组的溶源化菌株时，重组DNA分分子可以十分有效地插入染色体子可以十分有效地插入染色体DNA中。这种技术称之为中。这种技术称之为原原噬菌体转移技术噬菌体转移技术105载体+转化或感染原噬菌体DNA溶源化菌株染色体DNA同源重组具插入DNA的原噬菌体不再形成噬菌斑 ii. 标记基因标记基因 ) 抗生素抗性基因抗生素抗性基因 ) thy基因基因(三甲氧苄二氨嘧啶三甲氧苄二氨嘧啶)：该基因表达可导致枯草：该基因表达可导致枯草杆菌死亡，但当外源杆菌死亡，但当外源DNA插入该基因后，宿主细

10、胞便插入该基因后，宿主细胞便能存活能存活 iii. 表达载体的启动子表达载体的启动子 常用的有液化芽孢杆菌的常用的有液化芽孢杆菌的-淀粉酶基因启动子和淀粉酶基因启动子和sp2启动子启动子 2. 其它其它G+ 克隆载体克隆载体 1) 枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌色葡萄球菌 2) 嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒所组建的克隆载体所组建的克隆载体三、链霉菌克隆载体三、链霉菌克隆载体 1. 质粒载体质粒载体质粒名称质粒名称 大小大小(kb) 来源来源 宿主范围宿主范围 拷贝数拷

11、贝数 SLP1.2 14.5 天兰色链霉菌 窄谱,变青链霉菌 4-5 SCP2(性因子) 1-3 pIJ101 8.9 变青链霉菌 广谱(各种载体构建) 40-300 pFJ103 20 S.granulorubor 生二素,金霉素,弗氏链霉菌 pUC6 9.2 S.cepinosue 广谱 30-40 2. 噬菌体载体噬菌体载体 C31-天兰色链霉菌的温和噬菌体，长天兰色链霉菌的温和噬菌体，长41 kb，其中，其中32 kb是必须的是必须的, 具粘性末端的线状具粘性末端的线状DNA分子，可插入约分子，可插入约10 kb外源外源DNA，可裂解和溶源化生长。，可裂解和溶源化生长。 3. 标记基因

12、标记基因 杂合致死杂合致死（lethal zygosis,Ltz)lethal zygosis,Ltz)：凡是含有接合质粒：凡是含有接合质粒的链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可的链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这导致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种表型也可用于转化体的选择。种表型也可用于转化体的选择。 转化菌落变青链霉菌 第四节第四节 真菌分子克隆载体真菌分子克隆载体一、酿酒酵母一、酿酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的的分子克隆载体分子克隆载体 1.克隆载体的种类克隆

13、载体的种类 1) 按复制方式划分按复制方式划分 i. 自主复制型；自主复制型； ii. 整合型（非自主复制型）整合型（非自主复制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按复制子来源划分按复制子来源划分 i. 附加体型附加体型- yeast episomal plasmid(YEp)，其复制起，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒点来自于酿酒酵母的天然质粒-2质粒质粒 ii. 染色体复制型染色体复制型- Yeast Replicating plasmid(YRp)，其，其复制起点来自染色体上的自主复制序列复制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomou

14、s replicating sequence)TELURA3 2AmprTcrURA3 YIpYEp YRpYLp pYAC AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcrTcrURA3OriOriOriOriCENYCp AmprTcrURA3OriTRP1HIS4TELTELTEL2URA3AmprTELARS酿酒酵母载体的种类和构建酿酒酵母载体的种类和构建 * 若在若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体体YCp-Yeast Centrometric plasmid * 若在若在YCp 或或YRp 中插入一段酵母的端粒结构，该中插入一段酵母的端

15、粒结构，该质粒称之为质粒称之为YLp-Yeast Linear plasmid * 若将若将YLp质粒构建成环状分子质粒构建成环状分子,该质粒称之为该质粒称之为pYAC载体载体(Yeast Artificial Chromosome) 3) 标记基因标记基因 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如基因作为选择标记，如ARG4ARG4，LEU2LEU2，TRP1TRP1，HIS3HIS3和和URA3URA3。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或

16、多基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在子则是靠在E.coliE.coli的转化体中来鉴别的。的转化体中来鉴别的。 2. 酵母克隆载体的结构与特点酵母克隆载体的结构与特点 1) 穿梭载体，穿梭载体，YIp除外除外 2) 有适合两种生物的标记基因有适合两种生物的标记基因 3) 环状或线状环状或线状DNA 详见下表详见下表 载体类型载体类型 存在方式存在方式 所需所需DNA序列序列 标记基因标记基因 转化频率转化频率 稳定性稳定性 （菌落（菌落/gDNA）无丝分裂）无丝分裂 有丝分裂有丝分裂 整

17、合型整合型 整合整合 与染色体与染色体DNA Apr Tcr 10-1650140111_+/-+ND103 高高10-110-110-2 10-3 8. pYAC载体载体 酵母菌人工染色体酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建, 由由YLp经适当经适当改造后构建成改造后构建成pYAC载体。载体。pYAC载体具有以下特点：载体具有以下特点： 1） 双双TEL位点；位点； 2） 三个酵母菌遗传标记基因；三个酵母菌遗传标记基因； 3） 一个一个SUP4基因用于检测重组子基因用于

18、检测重组子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在SUP4基因基因中插入外源中插入外源DNA片段后在转化片段后在转化ade2宿主菌，转化子成红色宿主菌，转化子成红色菌落。菌落。AmprTELTELSup4CEN4 ARS1TRP1OripYAC4E Sm S X B X B pYAC OriTRP1TELTELHIS4AmprARSCENpYAC载体的结构载体的结构 9. 酵母杂交系统载体酵母杂交系统载体 主要用于研究

19、主要用于研究DNA-蛋白质和蛋白质蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的相互作蛋白质之间的相互作用，可用于新基因的克隆。该类载体可分为两类：用，可用于新基因的克隆。该类载体可分为两类： 一类载体中存在一个一类载体中存在一个DNA-结合序列结合序列(BD)，它与已知的钓，它与已知的钓饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（AD），），它则与未知或已知的捕猎序列融合。它则与未知或已知的捕猎序列融合。 单杂交系统载体单杂交系统载体 双杂交系统载体双杂交系统载体 三杂交系统载体三杂交系统载体 除上述普通型的各类载体外，还有其它不同功能的载体：除上述普通型的各类

20、载体外，还有其它不同功能的载体： 表达型表达型yeast expression plasmid; 启动子探针型启动子探针型yeast promoter plasmid, YPp; 杂合型杂合型yeast hybrid plasmid, YHp,与阅读框架探针型相同。与阅读框架探针型相同。Nonintercting proteinsAD BaitProteinDNA-BDLibraryProteinOperators or upstreamactivating sequencesPromoterReporter gene(s)Interacting proteins activate trans

21、cription of reporterAD BaitProteinLibraryProteinDNA-BDOperators or upstreamactivating sequencesPromoterReporter gene(s)transcriptionFigure 1.Schematic diagram of the basic foundation of the MATCHMAKER systems.pUC oriADMCSEcoR IXho ITRP1pB42AD 6.45kbAmprPGAL1TADH12 Ori双杂交系统和载体双杂交系统和载体二、丝状真菌克隆载体二、丝状真菌

22、克隆载体 1.丝状真菌的特点丝状真菌的特点 1） 属低等真核生物，结构简单，易于培养属低等真核生物，结构简单，易于培养 2） 基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，如内含子数目、位置等如内含子数目、位置等 3） 用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，如糖基化、蛋白质外泌如糖基化、蛋白质外泌 4） 有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚 2. 丝状真菌克隆载体丝状真菌克隆载体 1） 自主复制载体自主复制载体，其复制起点来源于以下三类，其复制起点来源于以下三类DNA：

23、i. 线粒体质粒，如来自间型脉孢菌线粒体质粒，如来自间型脉孢菌(N.intermedia)线线粒体质粒粒体质粒: pBR322+线粒体质粒线粒体质粒+qa-2+ pALS1 转化粗糙脉孢菌转化粗糙脉孢菌 pALS2（高频转化小质粒）（高频转化小质粒） ii. 类质粒（类质粒（plasmid-like)，如由柄孢壳菌，如由柄孢壳菌(Fedospora auseniw)的类质粒的类质粒(2539bp)所构建的克隆载体可达所构建的克隆载体可达1000-9000/g的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序列相同。点序列

24、与酵母和海拉细胞线粒体质粒复制子序列相同。 iii. 染色体复制子染色体复制子 )构巢曲霉（构巢曲霉（A.nidulans)复制子复制子 pILJ16(5.4kb)+AMA1(6.1kb) ARp1(4.5kb) 转化频率转化频率20,000/106原生质体原生质体250ngDNA，可在黑曲霉，可在黑曲霉(A.niger)和米曲霉和米曲霉(A.oryzae)以相同转化频率转化。以相同转化频率转化。10-30 copies/单倍体基因组单倍体基因组 )玉米黑粉菌玉米黑粉菌(Ustilago maydis)复制子复制子 9104 /ng DNA，25 copies/cell 2）整合型载体）整合型载体 由由E.coli克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因构成，转化频率构成，转化频率1-10/g DNA 3）标记基因）标记基因 amdsamds乙酰胺酶，乙酰胺酶，dirdir线粒体线粒体ATPATP合成酶，合成酶，qa-2-qa-2-分分解奎尼酸脱氢酶，解奎尼酸脱氢酶，acuDacuD异柠檬酸裂解酶，异柠檬酸裂解酶，HgyHgyr r潮潮霉素抗性。霉素抗性。 l基于大肠杆菌基于大肠杆菌F质粒构建的高容量低拷贝质质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。粒载体。克隆外源克隆外源DNA片断