[精品]基因组DNA甲基化的液相色谱质谱分析6-26

1、组织中全基因组dna甲基化的液相色谱串级质谱分析*张俊杰，张立坚，刘春安，张良滔，蔡春*(广东医学院,湛江，524023)摘要：建立液相色谱串联质谱测定组织屮全基因组dna甲基化水平的方法。采用苯酚氯 仿提取组织dna,提取的dna用88%甲酸在140°c裂解，dna裂解液加入同位素胞喀噪 作内标，经n2吹干后，用甲醇溶解，以液相色谱串联质谱检测胞吨噪和5甲基胞喘口定含 量，并计算全基因组中dna甲基化的水平。结果表明，胞u密噪的线性范围为 l-100ng/ml,相关系数为0.9974,相对标准偏差为0.704.09%； 5甲基胞"密碇的线性范围 为150ng/ml,相关系

2、数为0.9948,相对标准偏差为0.60%4.81%。胞喀呢和5甲基胞嗨 喘的检出限为lpg,日内相对标准偏差分别为1.864.67%,日间相对标准偏差为3.72 4.68%,胞喀噪和5甲基胞喘噪的加样回收率为86.52%105.14%。本文建立的方法检测组 织中dna甲基化程度，具有专一性强，操作简便的优点，能较好地满足全基因组dna甲 基化检测的要求。关键词：dna甲基化；液相色谱质谱联用；胞喀临5甲基胞喀旋analysis of global dna methylation in tissue by liquidchromatography tandem mass spectrumzha

3、ng jun-jie, zhang li-jian, liu chun-an, zhang liang-tao cai chun*(guangdong medical college, zhanjiang ,524023 )abstract： wc developed and validate a rapid, sensitive and specific lc/ms/ms method for determination of global dna methylation in tissue. dna was extracted by phcnol-chlorof()rm, hydrolyz

4、ed using 88% formic acid at 140°c, spiked with cytosine-2, 43c2?5n2 as internal standard, reconstituted in methanol and analyzed by lc/ms/ms with multiple reaction monitoring mode, to reflect the global dna methylation level of the tissue. results show that the limit of quantification was ing/m

5、l for both cytosine (cyt) and 5-methylcytosine (5mcyt), and the linear range of calibration curve was 1 50 ng/ml and 1 10ong/ml for 5mcyt and cyt respectively, with correlation coefficient higher than 0.99. the relative standard deviation (rsd) was 0.70-4.09% and 0.60%4.81% for cyt and 5mcyt respect

6、ively. the intra-day precision expressed as rsd ranged from 1.86% to 4.67%, while the inter-day values from 3.72% to 4.68% .the recovery ratio of method varied from 86.52% to 105.14%. this yielded a simple and reliable lc/ms/ms assay for detection of cyt and 5mcyt, thus enabling the evaluation of gl

7、obal dna methylation.key word: dna methylation, liquid chromatography-mass spectrum, cytosine, 5-methyl-cytosine收稿曰期：修回h期：第一作者：张俊杰(1985),男,在读研究生,药物分析与仪器分析。e-mail: zhjunjie357753 通讯作者：蔡春e-mail: caichundna甲基化是表观遗传学的重要组成部分，它是有核细胞特有的复制和转录后修饰， 能够在不改变基因组中碱基排序的情况下影响基因转录和表达，它涉及到个体发育，细胞 增殖、分化、基因印迹、x染色体失活，基因表

8、达调控和碱基突变等多方面的生物学功能 m,特别对肿瘤的发生和发展具有重要的生物学意义。肿瘤中dna甲基化模式发生改 变，表现为全基因组低甲基化和某些基因启动子cpg岛区的高甲基化。这种甲基化模式的 改变与肿瘤变化的关系，己经成为肿瘤研究的一个热点。dna甲基化的准确检测对于研究dna甲基化变化情况与疾病的关系极为重要。最近 有文献报道，dna经酶解后运用lc/ms/ms技术检测咗咙核昔的含量，从而计算dna 甲基化程度的报道®»此外，也有文献报道dna通过化学方法裂解后，采用gc/ms方 法进行喀卩定含量的检测。本文建立了化学方法将dna裂解后，运用lc/ms/ms测定咗

9、噪碱基含量的方法，评价dna的甲基化程度，并用建立的方法分析了六例结肠癌病人肿 瘤组织和正常结肠组织中全基因组dna甲基化的变化。1实验部分1.1仪器与试剂试剂：氯仿，异戊醇，十二烷基磺酸钠（sds）,无水乙醇,甲酸，乙二胺四乙酸二钠 （edta）和乙月青（分析纯级）；甲酸胺，甲酸（色谱纯级）；实验用水为milli-q超纯 水；三轻甲基胶基甲烷（tris）和tris饱和酚为生化试剂标准品：胞卩密旋（cytosine, cyt）和5-甲基胞卩密睫（5methylcytosine,5mcyt ）购于sigma公 司，同位素胞卩密i庭（cytosine-i?c,i5n2）购于 toronto res

10、earch chemicals inc.。仪器：sigma台式高速冷冻离心机3k15 （德国sigma公司），uv-2100型紫外可见分 光光度计（上海元析仪器有限公司），液相色谱串联质谱（aglicntl2006430a,美国安捷 伦公司）1.2储备液和工作液配制121储备液配制准确称取2mg cyt和5mcyt用甲醇溶解定容50ml,得浓度为40|ig/ml cyt和5mcyt 标准储备液；取2mg内标物cyt,3c,5n用甲醇溶解后，置于50ml容量瓶中定容到刻度， 得浓度为40pg/ml cyt13c15n标准储备液。所有储备液在20°c冰箱保存待用。1.2.2工作液配制临用

11、时取cyt储备液加甲醇稀释成浓度为100、75、50、40、25、10、7.5、5、2.5和 ing/ml；储备液加甲醇稀释成浓度为50、40、25、10、7.5、5、4、2.5、1和05ng/ml工 作液；临用时取40mg/ml cyt,3c,5n标准储备液加甲醇稀释成浓度为40ng/ml的cyt,3c,5n 内标工作液。1.3样品处理结肠癌病人手术后取少量肿瘤组织和肿瘤旁正常结肠粘膜组织置7(rc冰箱保存。1.3.1 dna 提取取0.05mg组织加入0.12ml蛋白酶k、4ml te缓冲液和0.48ml 10%sds,在45°c水 浴过夜，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25:2

12、4:1)进行提取，摇匀6000rpm离心5min, 取上清，重复提取一次；再加入等体积氯仿：异戊醇(24:1),摇匀6000rpm离心5min； 取上清加入1/10倍体积的3mol/l醋酸钠和2.5倍无水乙醇，12000rpm离心5min,倒去溶 液，加入iml te缓冲液溶解。用紫外可见分光光度计检测dna纯度，当 a260nm/a280nm=1.71.9视为纯dna。若有rna污染加入rnase a,然后重复以上步骤。1.3.2 dna 裂解取约2.5昭dna放入反应瓶中，用n?吹干，然后加入0.2ml 88%甲酸在140°c反应 90min待其冷却到室温后，用n2吹干，加入40

13、0pl甲醇溶解，15000mi，离心4min取 上清，待lc/ms分析。1.4仪器条件141液相色谱条件:aglient 1200型液相色谱仪,beh hilic色谱柱(1.7pmx2.lx 100mm, waters公司)；流动相：a为0.1%甲酸鞍，b为乙膳。流速：0.4ml/min；柱温为20°c, 进样量为5pl；洗脫程序：0lmin a为10%； 12min a从10%变为50%； 22.5min a 为 50%； 2.58min a 从 50%变为 10%1.4.2质谱条件：电喷雾正离子电离模式，离子源温度为300°c；喷雾电压为3.5kv,喷雾 气流量9l/m

14、in,入口电压为cyt和 为114v, cyt13c15n为115v。采用多反应监测模式检 测，碰撞能量：cyt和为20v, cyt叱&n为16v。cyt定量离子m/z 112>95,辅助定量离 子69, 5mcyt定量离子m/z 126>109,辅助定量离子83, cyt13c,5n定量离子m/z 115>97, 辅助定量离子70。1.5数据处理本实验采用内标法定量，以w (5mcyt) / w (5mcyt) + w (cyt) x 100%的方式来 表示dna甲基化程度。采用excell进行统计分析。2结果2.1和cyt质谱图分别用 lyg/ml cyt、40n

15、g/ml cytl,cl5n2 和 lpg/ml 5mcyt 标准溶液，进 5pl 经 ms/ms 分析，其质谱图如图 1,图>1' m/z 112 (m+h+) , m/z 115 (m+h+)和 m/z 126 <m+h+)分别为cyt、cyt,3c,5n和5mcyt分子离子峰；另外从图中可以看汕，m/z 112>95和m/z 126>109分别为cyt和主要的碎片离子，因此选用m/z 112>95和126>109作为cyt和的泄量检测。courts (%)vs. mass-tocharge (rr/z)acourts fx>) vs. m

16、asstcxchavge (n/z)c图 1 cyt> cyt13c15n2 和 5mcyt 子离子图fig. 1 product ion scan of cyt (a), cyt1 ci5n(b) and 5mcyt(c)2.3线性范围及精密度实验混合标准液包括5mcyt和cyt,其中质量浓度系列为0.5、1、2.5、4、5、7.5、10、25、40 和 50ng/ml, cyt 质量浓度系列为 1、2.5、4、5、7.5、10、25、40、50、75 和 100ng/ml,加入40ng/mlcyt13c,5n2作内标，分别进样5次。分别以cyt和5mcyt质量浓 度为横坐标，色谱峰面

17、积为纵坐标，绘制标准曲线，并以信噪比为3确定样品的最低检测 限。结果表明，cyt和5mcyt的检出限为lpg, cyt的线性范围为1100ng/ml,标准曲线 为y=1.2580x-0.6255,相关系数/为0.9974,相对标准偏差rsd为0.704.09%；的线性 范围为150ng/ml,标准曲线为y=1216.6212x-593.6998,相关系数2为0.9948,相对标准 偏差 rsd 为 0.604.81%。2.4重现性实验取同一样品按1.3方法制备3份进行测定cyt和5mcyt两个色谱峰的相对丰度rsd见 表1-表1结肠癌组织中cyt和5mcyt重现性tab 1 reproduci

18、bility of cyt and 5mcyt in colon cancercyt (ng/ml)(ng/ml)131.47981.5149231.86591.5256332.28361.4912rsd%1.26111.16542.5稳定性实验取同一 dna样品试液，在20°c保存分别2, 4, 6, 8, 10h测定cyt和5mcyt。以上 质谱峰相对丰度的rsd分别为1.86%和4.67%取同一 dna样品试液，在20°c保存分别于1, 2, 3, 4, 5d测定cyt和5mcyto以上 质谱峰相対丰度的rsd分别为3.72%和4.68%o2.6回收率实验取dna裂解

19、液分别加入cyt（50、10和ing/ml）和（50、10和ing/ml） 400gl加标定 fi, n?吹干，加入400|il甲醇溶解，15000mi离心5min,取上清液用于lc/ms分析， 测定cyt回收率分别为87.38%、105.14%和96.18%； 5mcyt回收率分别为89.58% 86.52%和 94.52%02.7结肠癌组织样品分析利用上述分析方法对6例结肠癌病人的结肠癌组织中dna甲基化水平进行了检测。 图2为标准品和cyt的mrm图，表2是结肠癌患者正常组织和肿瘤组织甲基化分析结 果。实验结果表明癌组织的甲基化水平低于相应的正常组织，这与文献报道一致，说明 本方法可以有

20、效地用于全基因组dna甲基化水平的检测。图2标准品cyt, cyt13c15n2和 的mrm图fig.2 mrm of cyt,cytl'c15n2 and in standard resolution表2结肠癌和正常组织样品甲基化分析结果tab 2 results of contents in colon cancer tissues and normal tissues正常组织肿瘤组织cyt(ng/ml)29.8001 32.283629.852631.1053(ng/ml)1.52901.87971.02971.4547/(cyt+)%4.88% 5.50%3.33% 4.46%

21、3讨论现在检测基因组dna甲基化主要有sssl甲基转移酶法和测序法，英屮sssl甲基转移 酶法由于sam和sssl甲基转移酶性质不稳定，易造成重复操作的同一实验结杲误差比较 大，必须设立自身对照来标化实验数据；测序法需要大量的克隆测序，较为繁琐，昂贵 1101 o最近报道lc/ms/ms测定喀噪核苛，此方法需要核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸 酶等酶水解dna,由于酶活性的影响可能存在由于酶解不完全带来的误差liri3o另外有 报道将dna利用化学方法裂解为u密呢后，通过衍生用gc/ms测定喀呢衍生物的含量，该 方法中口密碇的衍生增加了操作的难度。本方法通过化学裂解dna既排除酶解法可能带來

22、的误差，又不需要衍生，大大简化了操作。在实验过程中发现胞卩密睫和5甲基胞卩密呢在c18柱没有保留，通过改变洗脫溶剂仍未 能解决，釆用适合碱性化合物的hilic柱后，胞喀噪和5甲基喀噪实现了分离，并发现 hilic柱比c18柱的灵敏度高，这可能与hilic柱使用髙比例有机相有关。在实验过程中发现0.1%甲酸作为流动相时，胞喀唳和5甲基胞喀噪在柱上保留时间 基本一致，当流动相为ph=6或4.5的乙酸乙酸钱缓冲液时，色谱峰发生分岔的现象，而 ph=3.6的乙酸乙酸镀缓冲液作为流动相时，色谱峰没有分岔但是重现性不好，提示ph值 和缓冲体系对胞喀咙和5甲基胞陀咙的分析影响比较大，当加入0.1%甲酸讓水溶

23、液时, 胞喀唏和5甲基胞喀噪基木分离j1重现性较好。4参考文献1j boumil rm, lee jt. forty years of decoding the silence in x-chromosome inactivation. i ium mol genet. 2001. 10(20): 2225-32.2 lim i in, van oa. a multistep epigenetic switch enables the stable inheritance of dna methylation states. nat genet. 2007. 39(2): 269-75.3 f

24、lanagan jm, popcndikytc v, pozdniakovaitc n, ct al. intra- and intcrindividual epigenetic variation in human germ cells. am j hum genet. 2006. 79(1): 67-84.4 sha k. a mechanistic view of genomic imprinting. annu rev genomics hum genet. 2008. 9: 197-2165 song l, james sr, kazim l, karpf ar. specific

25、method for the determination of genomic dna methylation by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. anal chem. 2005. 77(2): 504-10.6 friso s, choi sw, dolnikowski gg, selhub j. a method to assess genomic dna methylation using high- performance liquid chromatography/ele

26、ctrospray ionization mass spectrometry. anal chem. 2002 74(17): 4526-31.7 kok rm, smith de, barto r, et al. global dna methylation measured by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: analytical technique, reference values and determinants in healthy subjects clin chem lab med. 2007. 45(7): 903-11.8 rossella f, polledri e, bollati v, baccarelli a，fustinoni s. development and validation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the assessment of genomic dna methylation. rapid commun mass spectrom. 2009. 23(17): 2637-46.9 hemand