Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用

1、smad蛋白在bmp2诱导成骨分化过程中的作用【摘要】目的研究smad蛋白在骨形态发生蛋 白？2 (bmp?2)诱导成骨分化过程中作用，探讨smad蛋白在 成骨分化期间信号传导的机制。方法将取自mdx大鼠颅盖 骨组织分离获得成骨细胞进行培养，培养的成骨细胞分组 加入不同浓度的bmp?2或bmp?2与trx2sara混合物后，用 反义pcr和westernblot斑点杂交对各组诱导成骨分化的 情况进行分析。体内实验中肌肉局部埋植bmp?2或bmp?2和 trx 2s ara,取不同时间点处死动物，制备组织切片，用so 染色进行组织学观察。结果b mp?2处理的成骨细胞碱性磷 酸酶增加，降钙素mr

2、na增加，s mad蛋白的表达水平呈剂 量依赖性增加。t rx2sara处理组出现碱性磷酸酶和降钙素 m rna下调。体内实验组织切片so染色显示，b mp?2处理 组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞构成 而trx2s ara处理组很少向软骨源细胞分化。结论s mad蛋 白在bm p?2诱导成骨分化中发挥重要的信号传导作用。【关键词】smad蛋白质类骨形态发生蛋白质类成骨分ab stract obje ctivet oinve stiga tethee ffec tofsmad pro teinonos te ogenesisi n ducedbybon emorphogene t

3、icprotein? 2(bmp?2)ca 1 varialost eoblastswe redreat edwithb rouplllascont nscripti onp edto analyseividedi ntot hreegr oups.group i weret mp?2;group ii wi thbmp?2an d trx2sara;g rolwithouta nytreatmen t .reverset ra cr (rt?p cr)a ndwest ernbl otwer eappli dif ferencia ti onofosteo b lasts. bmp?2and

4、trx2sar awerealsoin jectedinto g luteusofm ic e.tissue sam pleswer eobt ainedf romth esite ofinje ctio nforhis tol ogicalso of bothalkal i nephosphat ase(alp)and calcitoninm rnaoftheos t eoblastsf ro mgroup i i ncr eased, s mads leveli ncrea sedin adose? depe ndentma nne r. whilet he expressio n ofa

5、lpandca icitoninmrn aingroup iish owedasigni f icantdown re gulation .hi stologi cals ostain ingsh owedt hatbmp ?2tr eatedti ssu eswereco mp osedofcar t ilagewithl argepopulat ionofprolif erating, pr e ?hypertro ph icandhyp ert rophicc hond rocyte s. inc ontra st，trx 2sar aandbmp ?2t reatedti ss ues

6、exhibi tedseldomch ondrogenicp rotienplays animportan t roleinost eo genesisi ndu cedbybm p?2s ignali ng.key words s mad proteins ;b onemorpho g eneticprot eins:osteob lastdiffere ntiation;m echanism骨形态发生蛋白？2 (bmp ?2)是转化生长因子p (tgf? 0 )家族成员之一，可促进多种细胞的生长、分化和抑制 细胞的凋亡。在生长发育过程中，bmp?2是调节成骨的重要 生长因子。然而，关于bm

7、p?2在诱导成骨分化方面的作用 机制目前尚不清楚。为此，本研究旨在分析sma d蛋白在 bmp?2诱导新骨形成过程中的作用，探讨s mad蛋白在bmp2 诱导成骨分化过程中的作用机制。1材料和方法实验动物选择雄性mdx小鼠12只，23周龄，体质量2735g。细胞培养取m dx小鼠的颅盖骨，通过一系列酶消化方法分离获 得成骨细胞1，进行细胞培养，在培养板上细胞达到80% 的融合后分组，各组分别加入500、20 0、omg/l的bmp ?2 作用24h，收获细胞进行蛋白和rna分析。为观察bmp?2诱 导长期的成骨细胞分化，将培养的成骨细胞又分为3组：1组加入浓度为50 omg/l的bmp?2，2

8、组加入bmp?2和trx2 sara, 3组不加入任何物质做为对照。5 d后对细胞进行蛋 白和rna分析。反义pcr (rt?pcr)和westernbl o t斑点杂交分析 总r na应用tri zolr egent提取液提取，定量rt?pcr和we ster nblot斑点分析均按照ch0en等2 的方法进行 体内实验选择23周龄成年雄性大鼠。腹膜外注射咪达唑仑针 剂（m g/kg）深度麻醉3 omi n。右下肢备皮无菌准备后，在 臀部背面做5mm长的皮肤切口，于臀肌内通过钝性分离制 作一个肌腔隙。将动物分为两组：bm p?2注射组（i组） 和bmp?2与trx 2sara注射组（ii组）

9、。i组和ii组于海绵内装填50ug的bmp ?2,海绵冻干放入肌袋内，用5?0可 吸收线间断缝合肌肉和皮肤组织。在bmp?2植入前2d，ii 组动物注射10ug/l的tr x2sara。苏醒后笼内放养，正常 进食、饮水。在手术后2周处死动物。标本用40g /l的多 聚甲醛固定3d，4°c下在200g/l h）ta（ph）中脱钙5d。脱钙 后，标本用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，10pm厚切片，置于 t espa处理的载玻片上。切片脱蜡，通过梯度乙醇浸入水 中重新水化，随后进行so染色行组织学观察。2结果应用不同剂量的bmp?2处理24h，bmp?2处理的成骨细 胞主要向成骨细胞分化，表现为

10、碱性磷酸酶（alp）和降钙 素m rna增加，以及成骨细胞分化的基因表达增加（图1）。w estern blot杂交显示sma d蛋白的表达水平呈剂量依赖 性升高（图2）。b m p?2和trx2sa ra处理的成骨细胞，a lp 和降钙素mrna水平下降（图3、4）。组织切片so染色显示，术后2周bm p?2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞的软骨构成（5）。tr x2sara处理组很少向软骨源性分化，很少观察到肥 厚软骨细胞（图6）。3讨论骨形态发生蛋白是从骨基质分离提纯的一类能高效诱 导骨、软骨组织发生的酸性糖蛋白，是一组结构相关性的 多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性

11、，如参与早期胚胎 发生的身体构建，控制软骨、骨和性器官的形成，促进组 织修复，调节细胞的增殖、凋亡、分化和迁移，调节免疫 和内分泌功能等。到目前为止，共发现了 3 0多种的骨形态 发生蛋白3。bmp可分为几个亚族，bmp2和bmp 4结构高 度相似，bmp 5、bmp 6、bmp7和bmp 8在结构上相似，bmp2、 bmp4、bm p6和bmp7在体内可诱导骨和软骨形成4。smad蛋白家族是近年发现的新的细胞内信号传导蛋 白，直接参与骨形态发生蛋白等多个成员的信号转导5 7。在胚胎发生、个体形成、非对称器官的形成过程中具 有重要作用。在哺乳动物目前己经分离获得8种类型的 smad蛋白，根据其

12、结构和功能它们又被分为3个亚型：受 体调节的smads蛋白（r?smad）、共同介导的smads蛋白（ co?smad）和抑制性 smads 蛋白（an ti?sma d） 8。来自 bm p家族成员的信号作用于ii和i型丝氨酸?苏氨酸激酶受体，而后通过细胞内的多种蛋白传导其信号。活化的i型受 体与特定的r?sma d相互作用，并将其磷酸化。活化的 r?sma d与co?smad形成异聚复合体，并在核内积聚。核内 的异聚复合体可以直接或者通过其他dna结合蛋白间接与 dna结合，从而调节靶基因的转录。在smad信号转导过程中 也受到一些抑制信号的影响，如一种特异性的阻断smad信 号转导通路的

13、肽适体_trx 2sara9，其关键作用是在 bmp刺激时减少smad2、sma d3与smad 4形成的复合体，同 时介导活性s mad复合体的降解。本研究中bmp?2处理的成骨细胞向成骨分化，表现为 alp增加，降钙素mrna增加，成骨细胞分化的基因表达增 加以及smad蛋白的表达水平剂量依赖性增加。结果表明， bmp?2介导成骨分化期间s mad蛋白信号激活。为研宄sm ad信号对成熟成骨细胞的作用效果，本研究探讨了 sm ad 信号途径对b mp ?2诱导长期成骨分化的调节作用。实验中 用特异性的阻断smad信号转导通路的trx2s ara和bmp?2 一起处理小嵐颅盖骨成骨细胞，结果

14、trx2s ara对碱性磷酸 酶和降餌素m rna水平起到抑制作用，可见sm ad信号失调 抑制了 b mp?2介导的成骨细胞分化。体内实验表明， trx2sara介导smad蛋白的失活抑制了 bmp?2介导的软骨的 形成，提示sma d蛋白在bmp?2诱导软骨骨形成过程中起到 重要作用。【参考文献】1hi noie, fujim oris, t akem oria, et al. celldeat hb ypyruvate d eficiencyi nproliferat ivecultured calvarialo s teoblasts j .bioche mbi ophysre sco

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