1.2 基因工程的基本操作程序分享资料

1、.11.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序.2 目的基因的获取目的基因的获取 基因表达载体的构建（基因表达载体的构建（核心核心） 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定四四 个个 步步 骤骤.3一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因、目的基因主要主要是是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因（二）、获取目的基因的常用方法（二）、获取目的基因的常用方法从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增人工合成人工合成.41)1)基因文库？基因文库？1. 1. 从基因文库中获取目的基因从基因

2、文库中获取目的基因将含有将含有某种生物某种生物不同基因的许多不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到导入到受体菌受体菌的群体中，各个受体菌分别含的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库有这种生物的不同基因，称为基因文库2)2)基因文库的种类基因文库的种类: :种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文库文库.5受体菌的整个群体包含了这种生物的全部基因受体菌的整个群体包含了这种生物的全部基因基因组文库的构建模式图基因组文库的构建模

3、式图.6cDNA文库的构建模式图文库的构建模式图 杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶双链双链DNADNA( (cDNAcDNA) )某种生物的某种生物的mRNAmRNA某种酶某种酶DNADNA聚合酶聚合酶与载体连接后导入受体菌贮存，组成与载体连接后导入受体菌贮存，组成cDNAcDNA文库文库.7思考：思考：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能基因的功能基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置基因的转录产物基因的转录产物mRNA基因的表

4、达产物蛋白质基因的表达产物蛋白质根据基因的根据基因的有关信息有关信息概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。 多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段（2 2）利用）利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因过程过程.9变性变性复性复性延伸延伸.101. 1. 变性变性（90-9590-95）双链双链DNADNA模板在热作模板在热作用下，用下，_断裂，断裂，形成形成_氢键氢键单链单链DNADNA2.2.复性复性 (55-65)(55-65)温度降低，温度降低， 与与DNADNA模板结合，形成模板

5、结合，形成局部局部_。 双链双链引物引物3.3.延伸延伸（70-7570-75）在在 的作用下，的作用下，从引物的从引物的 连连接接 ，合，合 成与模板互补的成与模板互补的DNADNA链。链。 33端端脱氧核苷酸脱氧核苷酸TaqTaq酶酶.112 2、具体过程、具体过程.12原理：原理： . .DNADNA复制的原理复制的原理已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸1 1对引物对引物DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶) )条件条件模板模板原料原料酶酶引物引物能量能量.13PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同

6、同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶高温下变性解旋高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制(PCR扩增仪内扩增仪内)主要在细胞核内主要在细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）酶）大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子解旋酶、解旋酶、普通的普通的DNADNA聚合酶聚合酶等等.143.3.人工合成人工合成1)1)反转录法：反转录法： 杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA双链双链DN

7、ADNA( (cDNAcDNA) )目的基因目的基因的的mRNAmRNA某种酶某种酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶.152)2)根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成.16二、基因表达载体的构建（二、基因表达载体的构建（核心核心）使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以，并且可以遗传遗传给下一代给下一代使目的基因能够使目的基因能够表达和发挥作用表达和发挥作用1 1

8、、基因、基因表达载体表达载体构建的目的构建的目的？（？（P11P11）.172 2、基因表达载体的组成？、基因表达载体的组成？启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子标记基因标记基因1 1、启动子？终止子？标记基因？它们的作用是？、启动子？终止子？标记基因？它们的作用是？2 2、作为基因工程表达载体，只需含有目的基因、作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？就可以完成任务吗？3 3、基因表达载体的构建是千篇一律的吗？基因表达载体的构建是千篇一律的吗？.18三、将目的基因导入三、将目的基因导入受体细胞受体细胞目的基因进入目的基因进入_ _内，并且在受体内，并且在受体细胞内维持细胞

9、内维持_ _ _和和_ _的过程的过程转化转化: :受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达.191 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：易感染易感染双子叶植物双子叶植物和和裸子植物裸子植物，对大多数单，对大多数单子叶植物没有感染能力子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA（可转移的（可转移的DNA)可以转移到受体细胞，并且整合到可以转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的受体细胞染色体的DNA上。上。农杆菌特点：农杆菌特点：（1）农杆菌转化法）农杆菌转化法( 采用最多） .20两次拼接？两次导入？两次拼接？两次导入？组织培养技术组织培养技术.21

10、（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法.22 显微注射技术（最常用，最有效）显微注射技术（最常用，最有效）（3 3）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞方法方法受体细胞受体细胞常用受精卵常用受精卵动物细胞受精卵的全能性大动物细胞受精卵的全能性大目的基因的表达载体提纯目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物过程：过程：.23（2 2）将目的基因导入微生物细胞）将目的基因导入微生物细胞过程：过程：Ca2+处理受体细胞处理受体细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合重组表达载体与感受态细

11、胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。胞、遗传物质相对较少等。方法方法CaCa2+2+处理法处理法用用CaCa2 2处理，处理，增加细菌细增加细菌细胞壁的通透胞壁的通透性性思考：思考：为什么为什么要用要用Ca2+处理处理受体细胞？受体细胞？受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/ /个体个体农杆菌转化

12、法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）的是（）A.A.将毒素蛋白注射到受精卵中将毒素蛋白注射到受精卵中B.B.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.C.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并序列，与质粒重组

13、，注射到棉的子房并进入受精卵进入受精卵D.D.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，注射到棉受精卵中序列，注射到棉受精卵中.25四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否上是否插入了目的基因插入了目的基因1 1、导入检测、导入检测目的：目的：方法：方法：DNADNA分子杂交技分子杂交技术术.26从转基因生物中提取的基因组从转基因生物中提取的基因组DNADNA探针？探针？杂交的对象？杂交的对象？用放射性同位素标记的用放射性同位素标记的含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段过过程程.首先取出首先取出转基因生物的基

14、因组转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用片段用放射性同位素等作标记放射性同位素等作标记,以此做以此做探针探针。使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出若显示出杂交带杂交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中.272 2、转录检测、转录检测目的：目的：检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA方法：方法：分子杂交技术分子杂交技术用放射性同位素标记的用放射性同位素标记的含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段探针？探针？杂交的对象？杂交的对象？从转基因生物中提取的从转基因生物中提取的mRN

15、A.mRNA.3 3、翻译检测、翻译检测目的：目的：检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法: :抗原抗体杂交技术抗原抗体杂交技术从转基因生物中提取的蛋白质从转基因生物中提取的蛋白质抗原？抗原？抗体？抗体？将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体产生的相应抗体4、个体生物学水平的鉴定、个体生物学水平的鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等活性鉴定等.28DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如

16、果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 .29归纳: 基因工程的基本操作程序n获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成n构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因n将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 农杆菌转化法

17、、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法处理法n目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u 鉴定：鉴定：个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定.30.311.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起聚合酶结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没

18、有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能片断，它能阻碍阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落) ).32编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构.33原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的 组成的组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞