第十一章核酸的生物合成

1、2021-11-101第第十一十一章章 核酸的生物合成核酸的生物合成 DNA的生物合成的生物合成 RNA的生物合成的生物合成 基因工程简介基因工程简介2021-11-102 DNADNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在息以密码的形式编码在DNADNA分子上，表现为特定的核苷酸分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过排列顺序，并通过DNADNA的复制由亲代传递给子代。在后代的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自的生长发育过程中，遗传信息自DNADNA转录给转录给RNA,RNA,然后翻译然后翻译成特异的蛋

2、白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。亲代相似的遗传性状。中中 心心 法法 则则1964-1970 劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌RNA病毒、植物RNA病毒病毒（复制）病毒（复制）复制复制转录DNA RNA 蛋白质翻译逆转录逆转录1958年，遗传信息的单向自我复制自我复制转录转录反转录反转录自我复制自我复制翻译翻译蛋白质蛋白质遗传信息的传递遗传信息的传递2021-11-103 复制：复制：亲代亲代DNADNA或或RNARNA在一系列酶的作用下，生在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代成与亲代相同的子代DNADNA或或RNAR

3、NA的过程。的过程。转录：转录：以以DNADNA为模板，按照碱基配对原则将其所为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给含的遗传信息传给RNARNA，形成一条与，形成一条与DNADNA链互补链互补的的RNARNA的过程。的过程。翻译：翻译：亦叫转译，以亦叫转译，以mRNAmRNA为模板，将为模板，将mRNAmRNA的密的密码解读成蛋白质的码解读成蛋白质的AAAA顺序的过程。顺序的过程。逆转录：逆转录：以以RNARNA为模板，在逆转录酶的作用下，为模板，在逆转录酶的作用下，生成生成DNADNA的过程。的过程。Reverse transcription2021-11-104第一节第一节 DNA

4、的生物合成的生物合成 DNA的复制（的复制（DNA指导下的指导下的DNA合成）合成） 逆转录（逆转录（RNA指导下的指导下的DNA的合成）的合成） DNA的损伤与修复的损伤与修复( (修复合成修复合成) )一、一、DNA的复制的复制 uDNADNA复制复制是半保留的是半保留的uDNADNA复制的起点和方向复制的起点和方向u与与DNADNA复制有关的酶及蛋白质因子复制有关的酶及蛋白质因子u DNA DNA的半不连续复制的半不连续复制u E.coliE.coli.DNA.DNA复制过程复制过程u 真核生物真核生物DNADNA的复制的复制2021-11-106（一一）DNADNA的半保留复制的半保留

5、复制1 1、定义定义：由亲代由亲代DNADNA生成子代生成子代DNADNA时，每个新形成的子时，每个新形成的子代代DNADNA中，一条链来自亲代中，一条链来自亲代DNADNA，而另一条链则是新合，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫成的，这种复制方式叫半保留复制。半保留复制。半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据: :19581958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl用同位素用同位素1515N N标记大肠杆菌标记大肠杆菌DNA,DNA,首先证明了首先证明了DNADNA的半的半保留复制。保留复制。子代子代DNADNA双螺旋与亲代双螺旋与亲代DNADNA的碱基顺序完全

6、一样的碱基顺序完全一样2021-11-107细胞在细胞在1515N N标记培养基标记培养基中（中（NHNH4 4ClCl）连续培养）连续培养1515代，使所有代，使所有DNADNA分子分子均标记上均标记上1515N N，转入，转入1414N N标记的培养基标记的培养基CsClCsCl密度梯度离心密度梯度离心 浮力密度浮力密度 1515N NDNA 1.742g/mlDNA 1.742g/ml 14 14N NDNA DNA 1.710g/ml1.710g/ml1515N/ N/ 1414NDNA 1.717g/mlNDNA 1.717g/ml2 2、实验证据、实验证据2021-11-1083

7、3、DNA的半保留复制的生物学意义的半保留复制的生物学意义：nDNADNA的半保留复制的半保留复制保证亲代的遗传信息稳保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。定地传递给后代。 DNADNA在代谢上的稳定性并非指在代谢上的稳定性并非指DNADNA是一种惰性物是一种惰性物质质: :在细胞内外各种物化因子均可导致在细胞内外各种物化因子均可导致DNADNA损伤，损伤，需要修复；在复制和转录过程中需要修复；在复制和转录过程中DNADNA会发生损耗，会发生损耗，必须进行更新；在发育和进化过程中必须进行更新；在发育和进化过程中DNADNA可能进可能进行修饰、删除、扩增和重排；在进化的角度上，行修饰、删除、扩增和

8、重排；在进化的角度上，DNADNA更是处在不断的变异和发展中。更是处在不断的变异和发展中。2021-11-109（二二） 复制复制的的起点起点和和方向方向1 1、复制起点、复制起点（origin ， ori或或 o ， 复制原点）复制原点） 原核生物原核生物染色体染色体DNADNA（或真核生物的细胞器（或真核生物的细胞器DNADNA） 单复制起点，即整个染色体只有单复制起点，即整个染色体只有一个复制单位一个复制单位。 真核生物真核生物染色体染色体DNADNA多复制起点多复制起点，一个一个染色体染色体中中 有有多个复制单位多个复制单位。复制起点：复制起点：复制开始处复制开始处DNADNA分子的特

9、定位置分子的特定位置复制子复制子(Replicon)(Replicon)（复制单位（复制单位 ）：从一个起点到一个：从一个起点到一个终点所包含的终点所包含的DNADNA区域，是区域，是基因组基因组独立进行复制的单位。独立进行复制的单位。许多生物的复制起点都是富含许多生物的复制起点都是富含A A、T T的区段的区段2021-11-10102 2、复制方向、复制方向复制叉（复制叉（Replication Replication forkfork）：）：DNADNA复制进行时，在眼复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长的两侧出现两个叉子状的生长点点(growth point)(growth po

10、int)，叫，叫复制叉复制叉。在复制叉上分布着各种与复制在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为成的复合物称为复制体复制体（replisomereplisome）大多数复制是双向的，形成两个复大多数复制是双向的，形成两个复制叉制叉真核染色体真核染色体DNA DNA 线状双链线状双链E .coliE .coli染色体DNA 环状双链 复制眼复制眼（replication eyereplication eye）：电：电子显微镜下观察正在复制的子显微镜下观察正在复制的DNADNA，复，复制的区域形如一只眼睛制的区域形如一只眼睛。SV40（三）与（三

11、）与DNADNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质1 1、DNADNA聚合酶聚合酶2 2、拓扑异构酶、拓扑异构酶3 3、DNADNA解旋酶解旋酶4 4、单链结合蛋白、单链结合蛋白5 5、引发酶及引发体、引发酶及引发体6 6、DNADNA连接酶连接酶目前已发现目前已发现3030多种酶及蛋白质因子参与多种酶及蛋白质因子参与DNADNA复制复制1 1、 DNA聚合酶聚合酶( (DNA polymetases) )（1 1）反应需要有）反应需要有模板模板的指导；的指导；（2 2）4 4种种dNTP为底物，需要引物，为底物，需要引物，需要有需要有3 3 -OH-OH存在存在；（3 3）合成方向为）

12、合成方向为5 5 3 3 （4 4）需要）需要MgMg2+2+催化反应的特点：催化反应的特点：Mg2+2021-11-10132021-11-1014在大肠杆菌中发现主要有三种在大肠杆菌中发现主要有三种DNADNA聚合酶，分别为：聚合酶，分别为： DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 E.coliE.coli DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶IVIV和和V V：19991999年发现，当年发现，当DNADNA严重损伤严重损伤 时，时，诱导诱导产生。产生。2021-11-1015 DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 DN

13、A DNA聚合酶聚合酶 亚基数目亚基数目 1 1（单体酶）（单体酶） 多亚基酶多亚基酶 多亚基酶多亚基酶5 53 3聚合活性聚合活性 + + 中中 + + 很低很低 + + 很高很高3 3 5 5外切活性外切活性 + + + + + +5 5 3 3外切活性外切活性 + + 主要是对主要是对DNADNA损伤的损伤的修复；复制时切除修复；复制时切除RNARNA引物并填补其留引物并填补其留下的空隙。下的空隙。修复紫外光引起的修复紫外光引起的DNADNA损伤损伤DNA DNA 复制的主要复制的主要聚合酶，聚合酶，还具有还具有3 3 -5 -5 外切酶的校对外切酶的校对功能，提高功能，提高DNADNA

14、复制复制的保真性的保真性2021-11-1016DNADNA聚合酶聚合酶n是原核生物是原核生物DNADNA复制的主要聚合酶，复制的主要聚合酶，该酶由该酶由1010种种亚基组成，其中亚基组成，其中 、 、 形成全酶的形成全酶的核心酶核心酶。具。具有有5 5 3 3 DNA DNA聚合酶活性（聚合酶活性（ 亚基，亚基，速率高）；速率高）； 具有具有3 3 5 5 外切酶（外切酶（ 亚基）亚基）的校对功能，提的校对功能，提高高DNADNA复制的复制的保真性保真性。n 亚基象夹子一样夹住亚基象夹子一样夹住DNA,DNA,使聚合酶在完成复制使聚合酶在完成复制前不会脱离前不会脱离DNADNA分子。分子。1

15、7大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶III的亚基组成和功能分工的亚基组成和功能分工DNA聚合酶聚合酶全酶由全酶由1010种亚基组成，分子量种亚基组成，分子量830Kd ;830Kd ; 夹负载复合物夹负载复合物, ,在在随后链的每个冈崎随后链的每个冈崎片断上装载片断上装载亚基亚基拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNADNA一条链发生断裂和再连接一条链发生断裂和再连接。作用是松解负作用是松解负超螺旋超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录转录有有关。关。拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNADNA两条链发生断裂和再连接。两条链发生断裂和再连接。当引入负当

16、引入负超螺旋超螺旋时需要由时需要由ATPATP提供能量，同提供能量，同复制复制有关。有关。二者共同控制二者共同控制DNADNA的拓扑结构。的拓扑结构。2. 2. 拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerasetopoisomerase）通过催化通过催化DNADNA链的断裂、旋转和重新连接而改变链的断裂、旋转和重新连接而改变DNADNA的拓扑学性质。的拓扑学性质。2021-11-10203 3、解螺旋酶、解螺旋酶 （解链酶（解链酶，nelicasenelicase）：通过水：通过水解解ATPATP将将DNADNA两条链打开。两条链打开。E.coliE.coli中的中的reprep蛋蛋白就是解螺

17、旋酶，还有解螺旋酶白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I I、IIII、IIIIII。每解开一对碱基需要水解每解开一对碱基需要水解2 2个个ATPATP分子。分子。4 4、单链结合蛋白、单链结合蛋白(SSB-single-strand binding (SSB-single-strand binding protein)protein)：稳定已被解开的稳定已被解开的DNA单链阻止复性单链阻止复性，保护单链不被核酸酶降解。保护单链不被核酸酶降解。2021-11-10215 5、引发酶及引发体、引发酶及引发体引发前体引发前体: :它由多种蛋白质它由多种蛋白质dnaAdnaA、dnaBdnaB、dnaCdn

18、aC、n n、n n、n n和和i i组成。组成。引发酶引发酶( (引物酶，引物酶，primase)primase)：此酶以此酶以DNADNA为模板合成一为模板合成一段段RNA,RNA,这段这段RNARNA作为合成作为合成DNADNA的引物（的引物（Primer)Primer)。实质。实质是以是以DNADNA为模板的为模板的RNARNA聚合酶聚合酶。引发前体再与引发酶结引发前体再与引发酶结合组装成合组装成引发体。引发体。 引发体可以沿模板链引发体可以沿模板链5533方向移动方向移动, ,具有识别合具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RN

19、ARNA引物的合成。引物的合成。移动和引发均需要移动和引发均需要ATP提供能量，引发体的移动与提供能量，引发体的移动与复复制叉制叉移动的方向相同，与移动的方向相同，与冈崎片段冈崎片段的合成方向相反。的合成方向相反。（三）与（三）与DNADNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质1 1、DNADNA聚合酶聚合酶2 2、拓扑异构酶、拓扑异构酶3 3、DNADNA解旋酶解旋酶4 4、单链结合蛋白、单链结合蛋白5 5、引发酶及引发体、引发酶及引发体6 6、DNADNA连接酶连接酶2021-11-1023 DNADNA中一条链有切口，切口一端是中一条链有切口，切口一端是3 3-OH-OH，另一端是，

20、另一端是5 5- -磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，使磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，使切口切口连接。连接。不能将两条游离的不能将两条游离的DNADNA单链连接起来。单链连接起来。3535OHOH P P6 6、DNADNA连接酶连接酶（ligase）大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶要求连接酶要求NAD+NAD+提供能量，在高提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求等生物和噬菌体中，则要求ATPATP提供能量。提供能量。2021-11-1024v连接酶的反应机制连接酶的反应机制： 酶酶 + NAD + NAD+ +(ATP) (ATP) 酶酶-AMP

21、 + -AMP + 烟酰胺单核苷酸烟酰胺单核苷酸（PPiPPi） 酶酶-AMP + P-5-AMP + P-5-DNA -DNA 酶酶 + AMP + AMP- -P-5P-5-DNA-DNADNA-3DNA-3-OH + AMP-OH + AMP- -P-5-DNA P-5-DNA DNA-3DNA-3-O-P-5-DNA+AMP-O-P-5-DNA+AMPvDNADNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用用作用2021-11-1025酶酶-AMPAMP-P-5-DNA 磷酰胺键磷酰胺键以焦磷酸活化磷原子以焦磷酸活化磷原子

22、2021-11-1026拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物DNA双链双链 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质2021-11-1027拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物拓扑异构酶拓扑异构酶与与DNA双链双链结合，解开结合，解开超螺旋。超螺旋。 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质2021-11-1028拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DN

23、A聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物解链酶解开解链酶解开DNA双螺旋双螺旋 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质2021-11-1029拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白防止复螺旋防止复螺旋 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质2021-11-1030拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物引物酶合成引物引物酶合

24、成引物 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质( (四四) ) DNA的半不连续复制的半不连续复制问题的提出：问题的提出： 5 3 5 3链如何作为模板复制链如何作为模板复制 ? ?19681968年年冈崎冈崎提出提出DNADNA不连续复制模型不连续复制模型 2021-11-1032 1 1、冈崎片段的发现（、冈崎片段的发现（19681968）：）：n 同位素实验，同位素实验，3 3HdTHdT 短时间内为短时间内为DNADNA小片段小片段一段一段时间后时间后检测到检测到 DNADNA大片段。当用大片段。当用DNADNA连接酶的变连接酶的变异株时，检测到大量异株时，检测到

25、大量DNADNA片段的积累片段的积累 证明证明DNADNA复制中有小片段合成。复制中有小片段合成。n由由U U替代替代dTdT，被尿嘧啶，被尿嘧啶-DNA-DNA-糖苷酶切除。糖苷酶切除。测定测定DNADNA小片段，远远大于合成小片段，远远大于合成DNADNA的一半。的一半。n在缺少尿嘧啶在缺少尿嘧啶-N-N-糖基酶的突变株中，糖基酶的突变株中，检测到一半检测到一半3 3H H标记出现在小片段（冈崎片段）中。标记出现在小片段（冈崎片段）中。后两个实验表明：在后两个实验表明：在DNA复制时只有一条链是不连续的！复制时只有一条链是不连续的！2021-11-1033领头链领头链在在DNADNA复制时

26、，合成方向与复制叉移动的方复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链（向一致并连续合成的链（前导链前导链）。）。随后链随后链在在DNADNA复制时，合成方向与复制叉移动的方复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的整的DNADNA链（链（滞后链滞后链）。这些）。这些不连续的片断，称为不连续的片断，称为冈冈崎片断崎片断。每个冈崎片段的合成也都需要引物。每个冈崎片段的合成也都需要引物。冈崎片段冈崎片段：真核生物中真核生物中100-200100-200个核苷酸（核小体的个核苷酸（核小体的DNADNA单位）

27、。单位）。原核生物中原核生物中1000-20001000-2000个核苷酸。个核苷酸。 335533552 2、半不连续复制、半不连续复制半不连续复制半不连续复制（semidiscontinuous replication）在在DNA复制时，复制时，领头链是连续合成的领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。式称为半不连续复制。2021-11-1035冈崎片段合成后由冈崎片段合成后由DNA聚合酶聚合酶切除切除RNA引物引物并催化合成一段并催化合成一段DNA填填补留下的空隙。补留下的空隙。再由再由DNA连接酶连接酶把他们把他们

28、连成一条完整的子代链，连成一条完整的子代链，称为滞后链。称为滞后链。2021-11-1036( (五五) ) E.coli. .染色体染色体DNADNA复制过程复制过程 起 始 延 伸 终 止2021-11-1037解链引发延长复制复制起点起点RNARNA前体前体1 1、复制的起始、复制的起始 (initiation)2021-11-1038n大肠杆菌大肠杆菌复制的起点复制的起点由由245245个个bpbp构成，其序列构成，其序列 很保守，很保守，有两组短的重复：有两组短的重复： 3 3个个13 bp13 bp的序列和的序列和4 4个个9 bp9 bp的序列的序列2021-11-1039u20

29、个个DnaA结合在四组结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。环绕此复合物。u三组三组13bp重复区依次变性，重复区依次变性，产生开放型复合物。产生开放型复合物。uDnaB（解螺旋酶）解螺旋酶）在在DnaC协助下与开放复合物协助下与开放复合物结合，进一步解链。结合，进一步解链。u解链时带来的扭曲张力还解链时带来的扭曲张力还需需DNA旋转酶（属旋转酶（属DNA拓拓扑异构酶扑异构酶）引入）引入正正超螺旋超螺旋消除。消除。起起 始始 过过 程程2021-11-1040u单链结合蛋白单链结合蛋白( ( SSB）结结合在单链区，阻止复性和保合在单链区，阻止复性

30、和保护单链护单链DNADNA不被核酸酶降解不被核酸酶降解u引发体引发体：引物合成酶与各：引物合成酶与各种蛋白质因子构成的复合体种蛋白质因子构成的复合体（引发体引发体），以以DNA为模板为模板合成合成RNA引物（引物（ 6-106-10个碱个碱基）基）引发引发2021-11-1041复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物引物在在DNADNA的复制原点，的复制原点，双股双股螺旋解开螺旋解开，成单链状态，成单链状态，分别作为模板，合成其互分别作为模板，合成其互补单链。补单链。解链引发体在复制叉上移动，识引发体在复制叉上移动，识别合成的起始位点，别合成的起始位点， 引发引

31、发RNARNA引物的合成。引物的合成。领头链领头链先引先引发开始合成，以原来一条发开始合成，以原来一条DNADNA单链为模板（单链为模板（3 3 5), 5),按按5 5 3 3的方向合成一的方向合成一段段RNARNA引物链。领头链开始合引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其成后，随后链也开始合成其引物。在引物的引物。在引物的33端为游离端为游离的羟基。的羟基。复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物引物RNA引物合成引物合成大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质SSB解链酶解链酶引物引物引物酶引物酶拓扑异构酶拓扑异构酶打开打开D

32、NA超螺链超螺链合成合成防止复螺旋防止复螺旋打开双螺旋打开双螺旋2021-11-1044复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引引物物在在DNA聚合酶聚合酶的催化的催化下，以脱氧核糖核苷酸下，以脱氧核糖核苷酸为底物，在为底物，在RNA引物的引物的3端端加上脱氧核糖核苷酸。加上脱氧核糖核苷酸。2 2、DNA链的延伸链的延伸2021-11-1045DNADNA链的延伸链的延伸前导链前导链的合成由的合成由DNA pol.将将dNTP加到引物上，与复制叉前进加到引物上，与复制叉前进方向一致，连续合成。方向一致，连续合成。随后链随后链的合成以岗崎片断的形式的合成以岗崎片断的形式

33、进行。每个冈崎片段都需要一个进行。每个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由引物，链的延长反应由DNA pol.催化。催化。前导链与随后链合成之间的协调：前导链与随后链合成之间的协调：由同一由同一DNA pol.催化。催化。 DNA聚合酶聚合酶：合成主力酶：合成主力酶 DNA聚合酶聚合酶：在复制完成后切除在复制完成后切除RNARNA引物引物并填补并填补 DNA连接酶连接酶 ( (DNA ligase) )： 通过生成通过生成35-35-磷酸二磷酸二酯键连接两条酯键连接两条DNADNA链。链。2021-11-1046延 伸前导链只需要一个前导链只需要一个RNARNA引物，随后链的每一个冈崎

34、引物，随后链的每一个冈崎片段都需要一个片段都需要一个RNARNA引物。引物。链的延长反应由链的延长反应由DNA pol.DNA pol.催化。催化。复制体复制体：在：在DNADNA合成的生长点（既复制叉上）分布合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNADNA的的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制。的复制。2021-11-1047复制体沿着复制叉复制体沿着复制叉方向前进，同时进行方向前进，同时进行前导链和滞后链的合前导链和滞后链的合成。成。一分子的一分子的 DNA p

35、ol III. 协同合成前导链协同合成前导链和滞后链，因此滞后和滞后链，因此滞后链必须绕成一个突环。链必须绕成一个突环。55333355、和和三种亚基组成核心酶三种亚基组成核心酶, ,核心酶形成二聚体核心酶形成二聚体- -亚基犹如一个夹子夹住亚基犹如一个夹子夹住DNA分分子，并向前滑动，使子，并向前滑动，使DNA聚合酶聚合酶在完成复制前不再脱离在完成复制前不再脱离DNA48大肠杆菌大肠杆菌DNA复制的延伸复制的延伸 2021-11-10493 3、DNADNA合成的终止合成的终止E nE.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终有两个终止区域，分别结合专一性的终 止蛋白止蛋白 tus 序列

36、一：序列一：terE terD terAterE terD terA 序列二：序列二：terF terB terCterF terB terC共共6 6个终止位点。个终止位点。每个区域只对一个方向的复制叉起作用TusTus蛋白蛋白-ter-ter复合物阻止一个方复合物阻止一个方向的复制叉前移向的复制叉前移( (通过抑制DNA解旋酶而发挥终止作用)2021-11-1051终终 止止两个复制叉向前移动，最后在终止区相遇并停止两个复制叉向前移动，最后在终止区相遇并停止复制，由复制，由DNADNA聚合酶聚合酶填补空隙，最后由连接酶填补空隙，最后由连接酶封口。结果形成两个封口。结果形成两个DNADNA双

37、股螺旋分子。双股螺旋分子。2021-11-1052原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向拓扑异构拓扑异构酶酶DNA聚合聚合酶酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前导链前导链随后链随后链3 5 复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5 RNA引物引物3 3 DNA连连接酶接酶2021-11-1053( (六六) ) 确保确保DNADNA复制忠实性的机制复制忠实性的机制1、采用DNA聚合酶催化聚合反应2、依赖DNA聚合酶核酸外切酶活性3、使用RNA引物4、依赖核苷酸代谢库调节系统(保证dNTP的正常水平),多种

38、修复系统2021-11-1054（七）真核生物染色体（七）真核生物染色体DNA的复制的复制 1 1、真核和原核、真核和原核DNADNA复制比较复制比较、 、 、 、 负责核负责核DNADNA的复制的复制负责线粒体负责线粒体DNA的复制的复制较慢较慢较快较快2021-11-1055 在真核细胞内有五种在真核细胞内有五种DNADNA聚合酶聚合酶 （与细菌（与细菌DNADNA聚合酶的聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）性质基本相同：底物、模板、引物、方向） 定位定位 细胞核细胞核 细胞核细胞核 线粒体线粒体 细胞核细胞核 细胞核细胞核3 3 -5-5 外切外切 - - + + + - -

39、+ + +酶活性酶活性功能功能引物引物 合成合成修复修复作用作用线粒体线粒体DNADNA的复制的复制核核DNADNA的复制的复制修复修复作用作用2021-11-10562 2、真核生物中、真核生物中DNADNA的复制特点的复制特点 1 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。多复制子。2 2、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp.200bp.3 3、真核生物、真核生物DNADNA复制速度比原核慢。复制速度比原核慢。4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重

40、新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。快速生长时，往往采用更多的复制起点。5 5、真核生物有多种、真核生物有多种DNADNA聚合酶。聚合酶。6 6、真核生物线性染色体两端有、真核生物线性染色体两端有端粒端粒结构，防止染色体间的末端结构，防止染色体间的末端连接。由连接。由端粒酶端粒酶负责新合成链负责新合成链5 5 端端RNARNA引物切除后的填补，引物切除后的填补，以保持以保持端粒端粒的一定长度的一定长度。2021-11-1057真核生物染色体DNA复制过程中 组蛋白的装配v 核小体

41、的结构（核小体的结构（200bp200bp左右）左右）v 在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNADNA的的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，此，DNADNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。3、真核生物染色体、真核生物染色体DNA末端复制的问题末端复制的问题真核生物线状染色体在复制最后，真核生物线状染色体在复制最后，5 5末端末端RNAR

42、NA引物被切除后，无法向原核那样填补空引物被切除后，无法向原核那样填补空缺，如果没有特殊的机制合成末端序列，将缺，如果没有特殊的机制合成末端序列，将造成造成5 5末端序列缩短，染色体就会在细胞传末端序列缩短，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。代中变得越来越短。通过通过端粒酶端粒酶催化形成端粒结构来解决催化形成端粒结构来解决2021-11-1059复制叉复制叉复制叉复制叉终止区终止区 端粒结构端粒结构3 3 5 5 3 3 5 5 端粒结构端粒结构端粒酶是含端粒酶是含RNARNA的逆转录酶的逆转录酶端粒酶与细胞老化有关端粒酶与细胞老化有关端粒（端粒（telomerestelomeres） ：是

43、真核细胞染色体末：是真核细胞染色体末端所特有的结构，有许多串（端所特有的结构，有许多串（10001000串或更多）串或更多）短的重复序列组成，通常短的重复序列组成，通常3 3末端链是富含末端链是富含G G的的短序列。短序列。端粒酶端粒酶: :含有含有RNARNA和蛋白质（起和蛋白质（起DNADNA聚合酶的聚合酶的作用）两种组分，作用）两种组分，RNARNA分子约分子约150b150b，含有与重，含有与重复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合成的模板。成的模板。60端聚酶的作用机理端聚酶的作用机理 2021-11-1061端粒酶:含有RNA和蛋白质（起D

44、NA聚合酶的作用）两种组分，RNA分子约150b，含有于重复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合成的模板。2009年诺贝尔生理学或医学奖Elizabeth BlackburnCarol Greider美国加利福尼亚旧金山大学美国巴尔的摩约翰霍普金斯医学院美国哈佛医学院Jack Szostak发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理 （八）（八）DNADNA复制的其它方式复制的其它方式n大肠杆菌双链环状大肠杆菌双链环状DNADNA的复制的复制（一个复制起点，（一个复制起点，双向复制）双向复制）n真核细胞线状染色体真核细胞线状染色体DNADNA的复制方式的复制方式（多个复（多个复制起点，双向复制）制起

45、点，双向复制）n单向滚环式复制单向滚环式复制（噬菌体（噬菌体 X174DNAX174DNA单链环状）单链环状）3 D-D-环式复制方式环式复制方式（线粒体双链环状（线粒体双链环状DNADNA：两条链的复制起：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步；或同步为点不同位置，且复制不同步；或同步为2-D2-D环）环）切开正链，以负链切开正链，以负链为模板开始复制为模板开始复制64滚环复制滚环复制 65D环复制环复制 二、二、RNARNA指导的指导的DNADNA合成合成（逆转录）（逆转录）逆转录逆转录（reverse transcription）：以以RNA为为模板，在逆转录酶的作用模板，在逆转录酶的作

46、用下，生成下，生成DNA的过程。的过程。1970年年，Temin 和和Baltimore分别从劳氏肉瘤病毒和分别从劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒鼠白血病病毒(致癌致癌RNA病毒病毒)中发现中发现逆转录酶逆转录酶。所有已知的致癌所有已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶，因此被病毒都含有逆转录酶，因此被称为逆转录病毒（称为逆转录病毒（retrovirus）逆转录酶逆转录酶催化催化RNA指导的指导的DNA的合成需要：的合成需要：模板：模板：RNA引物：引物：RNA或或DNA底物：底物：dNTP二价阳离子：二价阳离子：Mg2+或或Mn2+ 沿沿5 3方向合成方向合成DNA（一）逆转录酶（一）逆转录酶 202

47、1-11-1068 用特异抑制物（放线菌素用特异抑制物（放线菌素D D）能抑制致癌）能抑制致癌RNARNA病毒的复制，而对一般病毒的复制，而对一般RNARNA病毒的复制无影响。病毒的复制无影响。已知已知放线菌素放线菌素D D专门抑制以专门抑制以DNADNA为模板的反应为模板的反应，可见致癌可见致癌RNARNA病毒的复制过程必然涉及到病毒的复制过程必然涉及到DNADNA。所以所以TeminTemin于于19641964年提出前病毒的假说。年提出前病毒的假说。 19751975年两人获得诺贝尔生理学与医学奖年两人获得诺贝尔生理学与医学奖逆转录酶逆转录酶的发现：的发现：依赖依赖RNA的的DNA聚合酶

48、聚合酶RNase H依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶（二）逆转录过程（二）逆转录过程以病毒（+）RNA为模板，合成互补的（-）DNA。 切除RNADNA杂种分子中的RNA 以（-）DNA链为模板，合成（+）DNA链 具有三种酶活力具有三种酶活力（1）依赖依赖RNA的的DNA聚合酶活力。聚合酶活力。（2）RNase H酶活力，水解酶活力，水解RNADNA杂种分子中的杂种分子中的RNA，可沿，可沿35和和53两个方向起外切酶作用。两个方向起外切酶作用。（3）依赖依赖DNA的的DNA聚合酶活力。聚合酶活力。RNA衣壳被膜逆转录酶转录转录翻翻译译整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞丢失被膜丢失衣壳逆

49、转录逆转录RNARNAcDNA衣壳蛋白被膜蛋白逆转录酶( (三三) )逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期当致癌当致癌RNARNA病毒侵染宿主病毒侵染宿主细胞时，病毒细胞时，病毒RNARNA及逆转及逆转录酶一起进入宿主细胞，录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的逆转录病毒自身带入的逆转录酶使酶使RNARNA逆转录成双链逆转录成双链DNADNA。2021-11-1071原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前导链前导链随后链随后链3 5 复制的起始DNA

50、链的合成与延长DNA链合成的终止5 RNA引物引物3 3 DNA连连接酶接酶复习复习2021-11-1072（1）病毒粒子侵染宿主细胞，病毒RNA和逆转录酶一起进入细胞。（2)RNA被逆转录成双链DNA （cDNA），进入细胞核。( RNA5端带有1分子的宿主tRNA，作为逆转录时的引物。（3）逆转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中（前病毒） 。（4）前病毒DNA随宿主染色体DNA进行复制，转录,产生基因组RNA(mRNA)，翻译出病毒蛋白（病毒RNA 无翻译活性）。（5） 基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。(三) 逆转录病毒的生活周期

51、2021-11-1073逆转录酶发现的理论和实践意义：逆转录酶发现的理论和实践意义：不能把不能把“中心法则中心法则”绝对化，遗传信息也可以从绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。19831983年，发现人类免疫缺陷病毒（年，发现人类免疫缺陷病毒（human immune deficience human immune deficience virus,HIVvir

52、us,HIV）, ,是一类逆转录病毒，感染是一类逆转录病毒，感染T T淋巴细胞后即淋巴细胞后即杀死杀死细胞，细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（ acquired acquired immunodeficiency syndrome,AIDSimmunodeficiency syndrome,AIDS获得性免疫缺陷综合症获得性免疫缺陷综合症）指指DNA结构和功能发生的改变结构和功能发生的改变：nDNA复制中的错误（复制中的错误（ 错配率约在错配率约在10-10左右）左右） nDNA的自发性化学变化的自发性化学变化 （碱基的脱氨基作用，（碱基的脱氨基

53、作用，C U）n物理因素物理因素（紫外线紫外线、电离辐射、电离辐射 )：如碱基交联：如碱基交联n化学因素化学因素(烷化剂，亚硝酸，嵌入剂烷化剂，亚硝酸，嵌入剂)：碱基修饰：碱基修饰三、三、DNA的损伤与修复的损伤与修复1、DNA的损伤的损伤2021-11-1075在一定条件下，生物体能使在一定条件下，生物体能使DNADNA的损的损伤得到修复伤得到修复: :暗修复暗修复（1）光裂合酶修复（2）切除修复（3）重组修复 （4）诱导修复（SOS修复）（5）错配修复2021-11-1076光复合酶光复合酶特异地和嘧啶二聚体结合特异地和嘧啶二聚体结合DNADNA被被紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂

54、合酶修复（光复活作用（光复活作用直接修复）直接修复）酶被可见光激活酶被可见光激活解聚解聚二聚体二聚体后酶被释放后酶被释放2021-11-1077切除修复切除修复一般DNA的两条链只有一条受损伤，在一系列酶的作用下可将损伤部分切除，根据互补链的序列对其进行修复。2021-11-1078 DNA的重组修复的重组修复是复制后的修复DNA链的损伤并未除去一直只存在母链上！若干代后相当于被稀释。胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体二聚体2021-11-1079SOS修复为DNA的损伤所诱导，产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率（所以会有所以会有2 2种结果：

55、修复或种结果：修复或变异（进化）变异（进化） ，这属于倾向差错的修复。2021-11-1080 错错 配配 修修 复复DNA在复制中发生错配，如果新合成的链被校对，基因编码信息可得到恢复；但如果模板链被校对，突变就被固定。生物体内存在错配修复系统：能够识生物体内存在错配修复系统：能够识别别“新新” “” “旧旧”链！链！( (依据甲基化依据甲基化) )2021-11-1081在一定条件下，生物体能使DNA的损伤得到修复:暗修复暗修复（1）光裂合酶修复（2）切除修复（3）重组修复 （4）诱导修复（SOS修复）（5）错配修复2021-11-1082 概念概念： DNA DNA分子中的核苷酸序列发生

56、永久性的改分子中的核苷酸序列发生永久性的改变，从而导致变，从而导致DNADNA的复制以及后来的转录和翻译产物的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNADNA的的突变突变。 产生：产生：DNADNA在复制中可能产生错配，但在复制中可能产生错配，但自然条件下发生的突自然条件下发生的突变率非常低变率非常低某些物理化学因素，如紫外线、电离辐射和化学诱某些物理化学因素，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂（烷化剂、碱基类似物、嵌入染料）等变剂（烷化剂、碱基类似物、嵌入染料）等突变的类型突变的类型 碱基对的置换碱基对的置换(substit

57、ution)转换：转换：两种嘌呤或两种嘧啶之间互换（常见）两种嘌呤或两种嘧啶之间互换（常见）颠换：颠换：嘌呤与嘧啶或嘧啶与嘌呤之间互换嘌呤与嘧啶或嘧啶与嘌呤之间互换 移码突变移码突变(framesshift mutation)2021-11-1084转换转换野生型基因野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution) -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G

58、-A-C-A-T-G-C-点突变点突变（HNOHNO2 2、NHNH2 2OHOH、烷化剂等）、烷化剂等）插入或缺失插入或缺失1-21-2个碱基个碱基 -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C- 插入插入A -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失T移码突变移码突变(framesshift mutation)2021-11-1085移码突变移码突变n由插入或缺失单个或由插入或缺失单个或2 2个碱基而改变整个基因序个碱基而改变整个基因序列、阅读框架的突变，称为列、阅读框架的突变，称为

59、移码突变。移码突变。2021-11-1086 沉默突变沉默突变 错义突变错义突变 无义突变无义突变2021-11-1087DNADNA的合成的合成：nDNADNA的复制的复制：以：以DNADNA为模板合成为模板合成DNADNA。n逆转录逆转录：以：以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA。n修复合成修复合成（DNADNA聚合酶聚合酶I I、连接酶、连接酶、修复修复酶系统酶系统等）等）2021-11-1088第二节第二节 RNARNA的生物合成的生物合成一、转录一、转录（一）概念（一）概念n转录（转录（transcriptiontranscription）：）：以以DNADNA的一条链为模

60、板在的一条链为模板在RNARNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与与DNADNA链的一定区段互补的链的一定区段互补的RNARNA链的过程称为转录。链的过程称为转录。转录的不对称性转录的不对称性( (asymmetricasymmetric transcriptiontranscription) )：在：在RNARNA的合成中，的合成中，DNADNA的两条链中仅有一条链可作为转的两条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。录的模板，称为转录的不对称性。n反义链反义链（无意义链，负链）：在（无意义链，负链）：在RNARNA的转录中，用的转