鸡蛋清溶菌酶对头孢他啶诱导的福氏志贺氏菌内毒素释放的抑制作用-精品

1、 中国中医研究院中药所硕士学位论文鸡蛋清溶菌酶对头孢他啶诱导的福氏志贺氏菌内毒素释放的抑制作用姓名:王丹申请学位级别:硕士专业:中药学指导教师:梁爱华;周钟鸣20030601中文摘要级中国中医研究院中药所硕士学位论文中文摘要菌血症和内毒素血症是革兰氏阴性败血症病人的两大致死状态。强力、高效的抗生素虽能有效地控制菌血症,但是病人的死亡率仍然很高,其原因可能与抗生素在杀死细菌的同时诱导细菌释放内毒素,引起或加重内毒素血症有关。因此,在应用抗菌素治疗的同时,应用其它具有中和内毒素的药物,将会改善病人的预后。通过激活巨噬细胞及血管内皮细胞而产生一系列的细胞因子,如肿瘤坏死因子、白细胞介素一一等,从而引

2、起或加重内毒素休克乃至死亡。另外,当激活巨噬细胞时,被活化的巨噬细胞产生分泌一氧化氮,并可形成一,从而引起组织细胞损害。头孢他啶是临床上常用的一种一内酰胺类抗菌素。有研究发现,与革兰氏阴性细菌共同培养时,可引起大量的释放到培养上清液中,该上清液可刺激巨噬细胞释放大量的炎性因子,造成严重的炎症反应。是具有多价阴离子特性的大分子物质,有些阳离子多肽能与之结合,并降低其毒性”。”。鸡蛋清原名鸡子白,首载于神农本草经集注。鸡蛋清具有润肺利咽,清热解毒的功能。鸡蛋清中含有一种多肤成分一溶菌酶,¨,近年研究发现,是一种富含阳离子的蛋白质,这种蛋白质与一内酰胺类抗生素联合应用于大肠埃希氏菌培养时,

3、?对诱导的大肠埃希氏菌释放有抑制作用,从而降低其培养上清液对巨噬细胞昀激活,减少炎性因子的释放,减轻炎症反应。表明?可能有中和的作用。福氏志贺氏菌是肠杆菌中一种最常见的病原菌,有强烈的内毒素,引起人类的细菌性痢疾。在婴幼儿可引起急性中毒性痢疾,死亡率较高。临床上,细菌性痢疾,尤其是中毒性痢疾可能会因为细菌释放内毒素入血而引起较严重的毒血症。如果用?与抗菌素联合使用,即能控制菌血症,又能抑制内毒素释放,则可能会改善病人预后,这将在治疗上具有较大的意义。为此中文摘要级中周中医研究院中药所硕士学位论文本课题将通过体外及动物体内实验研究?对诱导的福氏志贺氏菌内毒素及其致炎活性物质释放的影响;并通过细菌

4、形态学及分子生物学实验探讨?抑制诱导的释放及致炎症反应的机理。通过抗原性实验探讨?在动物体内的给药途径。为?的研究开发提供理论依据。.体外研究采用系列稀释法测定对福氏志贺氏菌的最低抑菌浓度。采用肉汤和稀释的兔血液培养系统,取 细菌母液加入到含或不合?的营养肉汤和稀释的兔血液中,于水浴中震荡培养一段时间,在细菌指数生长期向各试管中加入,继续培养一定时闽,终止培养。将细菌悬液做系列稀释,采用营养琼脂平板接种,计数各培养管中存活的细菌数,探讨单独或与联合应用对细菌活性的影响。将上述细菌悬液离心收集上清液,储存于一备用。将细菌上清液作适当稀释后,用偶氮显色法测定释放到上清液中的浓度,探讨联合用药时&#

5、168;对诱导的释放的影响。将细菌培养上清液加入到培养好的巨噬细胞中。用法和染料摄入法测定其对巨噬细胞炎性因子龋的诱生能力。用试剂测定其对巨噬细胞炎性因子的诱生能力。探讨耻与联合用药组的细菌培养上清液对巨噬细胞中炎性因子的诱生能力。结果表明:对福氏志贺氏菌的为./。营养肉汤培养系统中、】/单独应用可迅速杀死细菌;?单独应用对细菌生长无明显影响;而.与联合使用保持了与单独用药相当的杀菌作用,菌落计数结果与单独用药组相近。在稀释的兔血液培养液中,、/单独用药组对福氏志贺氏菌有较强的杀菌作用.,但较在肉汤中弱,联合用药较单独用药有更强的杀菌作用.。在营养肉汤和稀释的兔血液培养液中,、/单独处理组均可

6、造成细菌迅速溶解,导致大量的释放到培养上渍液中,与无处理对照组比较.,其细菌上清液在体外培养的巨噬细胞上可诱导大量的炎性因子如肿瘤坏死因子【、一氧化氮产生,与无处理对照组比较.:而与联合用药后可阻止细菌溶解,显著降低的释放.,中文摘要级中国中医研究院中药所硕士学位论文【、等炎性因子的产降低其细菌培养上清液对巨噬细胞的激活,减少生,与单独处理组比较.。结果提示:联合用药时对的杀菌能力无明显影响,在有血液成分存在时,联合用药较单独使用有更强的杀菌能力。联合用药时?能抑制由诱导的细菌溶解,降低细菌释放到培养上清液中,从而减少其上清液对巨噬细胞的激活,减少炎性因子的产生。.动物体内研究.与联合应用对腹

7、膜炎败血症小鼠及家兔体内的释放的影响给小鼠、家兔腹腔注射福氏志贺氏菌肉汤培养悬液造成腹膜炎败血症模型,后,分别给各组小鼠、家兔腹腔注射或?/。小鼠于给药后、小时经心脏取血,家兔于给药后、和小时经心脏取血,离心后分离血浆,用偶氮显色法测定备组小鼠、家兔血浆中浓度。探讨?与联合用药治疗腹膜炎败血症小鼠和家兔对动物体内释放的影响。结果表明:在腹膜炎败血症小鼠和家兔体内,单独用药治疗组可造成细菌迅速溶解,导致大量的释放到血液中,与无处理对照组比较.;?与联合用药与单独用药组比较,可显著减少腹膜炎败血症小鼠和家兔血浆中的浓度.。.内毒素血症小鼠及腹膜炎败血症家兔体内的炎症反应给小鼠腹腔注射角叉菜胶/只,

8、小时后,将上述细菌肉汤培养上清液用生理盐水稀释倍经尾静脉注入小鼠体内,造成内毒素血症模型,小时后经心脏取血,离心后分离血浆,用染料摄入法测定内毒素血症小鼠和上述腹膜炎败血症家兔血浆中?【的浓度。用 试剂测定腹膜炎败血症家兔血浆中的浓度。 探讨联合用药治疗内毒素血症小鼠及腹膜炎败血症家兔对动物炎症反应的影响。结果表明:单独用药组的细菌肉汤培养上清液在小鼠体内诱导大量的?【产生,与无处理对照组细菌上清液在小鼠体内诱导产生的?【比较有显著差异.:而?与联合用药后可阻止细菌溶解,降低细菌释放到细菌培养上清液中,.一中文摘要级中国中医研究院中药所硕士学位论文从而降低其对小鼠体内巨噬细胞的激活,减少小鼠体

9、内的产生,与单独处理组比较.。联合用药治疗腹膜炎败血症家兔可显著降低家兔血】。结果提浆中?和的产生水平,与单独用药治疗组比较示:单独治疗败血症时可诱导释放大量的,从而引起或加重内毒素血症,导致明显的炎症反应;而与¨联合应用可降低的释放减轻炎症反应,从而减轻内毒素血症。.联合用药对腹膜炎败血症小鼠的死亡保护作用,给小鼠腹腔注射角叉菜胶/只,小时后,腹腔注射细菌肉汤培养悬液,造成腹膜炎败血症模型。后分别给各组小鼠腹腔注射或榉斟/进行治疗。从给药当日起乳。到绘药后第天,观察并记录小鼠存活率。探讨联合用药对小鼠存活率的影响。结果表明:未采取任何治疗的腹膜炎败血症小鼠在小时内全部死亡。单独用/

10、治疗组虽然在小时内其小鼠生存率与感染对照组比较有所提高,但到小时其小鼠存活率下降到%。单独用一、/组的小鼠存活率略高于感染对照组,但两组间在统计学上无显著差异。在/与】、/联合用药组中,无论是小鼠平均存活时间还是小鼠存活率璁高于其他各组,与感染对照缀及单独用组比较,在统计学上均有显著差异.。结果提示:采用较高剂量的对腹膜炎败血症小鼠未见明显的死亡保护作用。而?蹦与联合应用可显著提高感染小鼠的存活率,对腹膜炎败血症引起的小鼠死亡具有保护作用。.?的抗原性研究。为了探讨在临床应用的可行性,我们采用豚鼠隔日腹腔注射?溶液,/只,对照组隔日腹腔注射生理盐水,连续次,分别在第一次给药后的第天和第天给豚鼠

11、静脉注射样品溶液/只,对照组注射生理盐水,只/次/组,观察并记录第一次和第二次攻击后豚鼠出现的咳嗽、呼吸困难及抽搐跌倒等症状,;了解?的抗原性,探讨?在动物体内的给药途径。结果表明:弘./静脉给予豚鼠攻击后,可造成豚鼠严重过敏反应,而腹腔给予豚鼠攻击后,豚鼠无过敏反应;如果降低浓度采用聃乙./给豚鼠静脉注射,可造成豚鼠轻微过敏反应;中文摘要级中国中医研究院中药所硕士学位论文?./以下静脉给予豚鼠后,豚鼠未见过敏反应。结果提示:静脉注射较高浓度的?时可引起明显的过敏反应,降低?浓度可使过敏反应程度减轻或不出现过敏反应,而腹腔注射不引起过敏反应,提示腹腔给药比静脉给药安全。.作用机理研究.抑制细菌

12、内毒素释放的机理研究分别采用光学显微镜和扫描电子显微镜观察单独用或联合使用?/后的细菌形态。将细菌肉汤培养悬液滴于载玻片上,盖上盖玻片,于光学显微镜下观察各培养管中细菌的形态。将细菌肉汤培养悬液离心,弃去细菌上清液,分别用%戊二醛、%锇酸固定细菌,离心弃去上清液,再用不同浓度的丙酮脱水,在扫描电镜下观察细菌形态。通过对细菌形态的观察探讨联合用药抑制诱导的细菌溶解及释放的机理。结果表明:光学显微镜、扫描电镜下观察,?单独用药组中存活细菌很多,存活的细菌形态与对照组一致;而、 儿单独用药组中存活的细菌很少,镜下观察存活的细菌形态与对照组一致; ./、单独处理组中细菌很多,有部分细菌形态呈长丝状;?

13、与几联合用药组中存活的细菌较少,死亡的细菌相互粘连,形成聚集体。扫描电镜下观察,能清楚地看到/单独处理组中细菌裂解成不规则形状,有的细菌未完全裂解,细菌轮廓模糊,有些细菌形态与未加药处理组细菌形态一致;./单独处理组中细菌很多,有部分细菌形态呈长丝状;与./联合用药组中细菌呈长丝状,且有部分丝状细菌相互粘连,形成聚集体。结果提示:单独用药造成的细菌裂解可能是引起内毒素大量释放的主要原因,与?联合用药可使细菌彼此粘连形成聚集体,从而抑制了细菌裂解,最终抑制了诱导的释放,其结果可降低对巨噬细胞的激活,减少炎性因子的释放,减轻炎症反应。.抑制致炎活性物质释放的机理将细菌肉汤培养上清液加入到培养的巨噬

14、细胞中,用印迹法检中文摘要级中周中医研究院中药所硕士学位论文测蛋白的表达。结果表明:细胞对照组中无明显表达;/对照在巨噬细胞中诱导蛋白的高表达;各组细菌肉汤培养上清液均能在/单独处理组的细菌培养上清液在巨噬细胞中诱导的表达,巨噬细胞中诱导的表达比无处理细菌对照组轻度增高;?.、./与/联合用药组与/单独用药组比较,其在巨噬细胞中诱导的表达有所降低,其中.几与/联合用药组在巨噬细胞中诱导的表达降低比较明显。结果提示:联合用药可能通过下调的表达,从而抑制炎性因子的产生,降低炎症反应。综上所述在体外及体内实验中,弘能阻止引起的细菌溶解,降低细菌致炎活性物质主要包括的释放,减少致炎活性物质对巨噬细胞的

15、激活,降低【、等炎性因子的产生,减轻内毒素血症及其炎症反应,降低死亡率。提示?与联合应用治疗革兰氏阴性菌所致的脓毒血症有一定的应用前景。关键词:鸡蛋清溶菌酶 内毒素炎症因子抗生素墨堕要堡主宴主墨翌窒堕±堕堑堡主兰竺堡苎锄,埘【.?【 曲. 咖锄 . ,“ 哪?,锄 一. 任色 ,. 曙晰,。. 也? , 懈旭. :锄., , 曲 也. 色 谢?. 锄.撕 、仃 锄蚵.印,够砌袒胁咖明纪砌此,. ”曲埘英文摘要。级中同中医研究院中药所颤:学位论文 疏., 枷追 时 板强 .、知奄口 两辔妇彭册箨寥啦.出缸.舶而弘砌咖口? 】 七砌 .号越, .砌姆砌妙她耙融 ,鼢妒鼯口西喁删把砌哦出

16、司燃麟 醅珏酊?,鑫 砸世 . . 口一 ,删卸 .协行儿 .而如盯.嵇.,锝 ,呦砬幻一瑾? 丘 .、豫吐.丁啦血鹾叮娟泌.册 妨增盯口加”耙,抽孽.删,仃 、血仃 岫,胁譬山叫,%ר如/;印 .墨苎塑蔓望里主墨竺窒堕主垫堕堡主兰些堡苎、 ?./恐、 /, .,. ./仃, 心血.?./、,.鼢堙口遵邺耙 印如 、订、/、 .吼.丘晰. ?,甜 也 艇.叩丹锄.谢 诅 廿 、 .印谢 锄时曲, 】. 舵廿 . .鼢谚如如胁 . ,叩 印“、阢/. ,印矗英文摘要级中国中医研究院中药所硕士学位论文 .【, . 唱锄、/谢. . 髓 . 印而猢 ,、.丘 .疳 .埘 /.血

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18、锄仃们.,?/仃,., .、.弛 色 也咖 “也也伊.、.,/.班/ , 、./仃咖 ,锄衄印,锄. .谢? 盯,./?【.级中国中医研究院中药所硕士学位论文英文摘要 /拙猢 .衄曲锄缸.:;日;级中周巾压研究院中药所硕士学位论文 英文缩路词表英文缩略词表缩略词英文中文过硫酸铵杀菌性通透增加蛋白?牛血清白蛋白“头孢他啶】;】乱 弥漫性血管内凝血“二硫苏檐醇乙二胺四乙酸锄.、纠 鸡蛋清溶菌酶札拇 踟癌症研究所.白介素一.白介素一小诱导型一氧化氮合成酶口千遒尔萌 脂多糖结合蛋白内毒素蹯菌晦单克睦抗体帅唧砌 多器官功能衰竭§新生小牛血清一氧化氮订中性白细胞肽抗茵 蛋白髓【磷酸盐缓冲液巾苯甲

19、基磺酰氟讯”聚偏氟乙酸膜重组内毒素中和蛋白.级中国中医研究院中药所硕学位论文英文缩略词表每分钟转速?十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳行色 三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液.卜旺肿瘤坏死因子一【三羟甲基氨基甲烷前言级中国中医研究院中药所硕士学位论文刖 吾由革兰氏阴性细菌引起的各种感染仍是目前临床上主要的并发症和死亡原因之一。对于革兰氏阴性菌败血症病人,即使应用广谱、高效的抗生素有效地控制菌血症,但对抗茵治疗过程中产生的一系列严重反应,如发热、中毒性休克及多器官功能衰竭等仍然没有取得防治的根本性进展,临床资料证明病人的死亡率仍然很高,其原因可能与抗菌药诱导细菌释放内毒素,“”以及由引起的严重损害的作用机理

20、未完全阐明有关“,尽管其发病机制未完全阐明,一般认为细菌及其毒素促发机体产生的过度炎症反应可能具有重要作用。研究表明,抗菌药引起的细菌裂解与其诱导的释放有明显的关系,由于释放出的可溶性比其固着于菌体时的活性要高得多,一旦大量的从菌体释放到血液或体液中,将会产生强烈的毒性反应。细菡内毒素所引起的多种生物学效应及致病作用除了其直接作用外,还通过作用于体内单核一巨噬细胞,诱导分泌多种炎性介质如肿瘤坏死因子?【、白细胞介素一一”?和一氧化氮”“”等而发挥其效应作用。卜是脓毒性休克发病机制的关键介质”。在内毒素休克时,进入血中可刺激全身组织脏器内的巨噬细胞,产生大量的【进入血液循环,而?【又可以激活、启

21、动其他细胞因子的活性,形成一个恶性循环,已发现?【与内毒素血症严重度平行,卜【越高,内毒素血症越严重“。是由一精氨酸通过一氧化氮合成酶合成。结构型在正常情况下即可合成,参与调解机体的正常生理功能;诱导型在病理情况下活性增加,合成大量的,参与对各脏器功能的损害。而内毒素血症时释放过多主要为激活。在内毒素血疰中?对释放有重要作用”?主要是巨噬细胞等对一【发生作用,可强烈激活这些细胞内蛋白启动子、产生,从而合成大量的。在内毒素休克时,与内毒素血症严重度平行,内毒素血症越严重,血浆越高”。在内毒素休克时为一个重要指标,对休克严重度的判断有重要作用。对血管有损害作用,引起血管系统低反应性,出现血压下降,

22、微循环灌注不足,多器官功能衰竭等,使休克进一步恶化,对血中含量的监测,对判断病情严重前言级中国中医研究院中药所硕士学位论文程度,估计预后有重要作用”有些杀菌性抗菌药如:一内酰胺类抗生素的杀菌作用就是通过影响细菌细胞壁的合成,从而造成细胞壁缺陷,随之导致细菌裂解而实现的。有研究发现”,一内酰胺类抗生素头孢他啶与革兰氏阴性细菌共同培养时,可引起大量的内毒素释放到培养上清液中,该上清液可刺激巨噬细胞释放大量的炎性因子。因此,对于这些抗菌药来说,清除菌血症和可能诱导的内毒素血症成为治疗败血症过程中的矛盾。只有将这对矛盾合理地解决,才能降低病人的死亡率。尽管近年来已发现了许多新的拮抗剂,但多数仍停留在探

23、索阶段。另外,随着对抗生素作用机制认识的加深,已经发现一些抗生素具有中和或减少释放的能力。如:多粘菌素一右旋糖酐、多粘菌素?等。该类复合制剂降低了肾毒性,仍保留了杀菌力和中和的能力”。正在开发的新一代碳青霉烯类抗生素一,不需与脱氢肽酶抑制剂联用,杀菌作用更强,副作用更轻,尤其对大肠杆菌、。,绿脓杆菌,。、:、一显示出强的亲和性。其特性明显优于第一代的伊米配能。选用优先与结合的抗生素,既能杀菌,又能减少的释放,可以提高严重感染性疾病的救治水平”。是具有多价阴离子特性的大分子物质,有些阳离子多肽能与之结合,并降低其毒性“”。鸡蛋清原名鸡子白,首载于神农本草经集注,名医别录名鸡卵白,食疗本草名鸡子清

24、,今通称鸡蛋清。鸡蛋清具有润肺利咽,清热解毒的功能。鸡蛋清中含有一种多肽成分一溶菌酶,近年研究发现,?是一种富含阳离子的蛋白质,这种蛋白质与一内酰胺类抗生素联合应用于大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌等细菌培养时,可明显阻止抗菌药诱导的细菌溶解,并使释放到培养上清液中的内毒素含量明显降低,且同时对抗菌药的杀菌效力无明显影响。细菌经?与抗菌药共同作用后,其培养上清液对动物的致炎活性明显减弱,在动物体内诱导的?【和一生成明显减少。?与抗菌药联合治疗粒细胞减少症合并大肠埃希氏菌腹膜感染的小鼠,动物存活率较单独用抗菌药治疗时增高”“”杀菌与溶菌及内毒素释放明显分离的作用,对于败血症的治疗有益处。有研究发现”,

25、?与抗生素联合使用即能抑制绿脓杆菌级中国中医研究院中药所硕士学位论文的生长,又能减轻内毒素释放,提示将?与抗生素联合应用对于绿脓杆菌感染,如烧伤合并绿脓杆菌性败血症的治疗可能具有一定的应用前景。福氏志贺氏菌是肠杆菌中一种最常见的病原菌,有强烈的内毒素,引起人类的细菌性痢疾。在婴幼儿可引起急性中毒性痢疾,死亡率较高。临床上,细菌性痢疾,尤其是中毒性痢疾可能会因为细菌释放内毒素入血而引起较严重的毒血症。如果用?与抗菌素联合使用,即能控制菌血症,又能抑制内毒素释放,则可能会改善病人预后,这将在治疗上具有较大的意义。本课题将通过体外、体内、细菌形态学及分子生物学研究对诱导的福氏志贺氏菌释放的抑制作用及

26、其机理,及由此降低内毒素血症发生、减轻炎症反应、改善痢疾病人预后的可能性。文献综述级中国中医研究院中药所硕士学位论文文献综述抗生素诱导的细菌内毒素释放的研究进展由革兰氏阴性细菌引起的各种感染仍是目前临床上主要的并发症和死亡原因之一。对于革兰氏阴性菌败血症病人,即使应用广谱、高效的抗生素有效地控制菌血症,但对抗菌治疗过程中产生的一系列严重反应,如发热、中毒性休克及多器官功能衰竭等仍然没有取得防治的根本性进展,临床资料证明病人的死亡率仍然很高,其原因可能与抗菌药诱导细菌释放内毒素,“以及由引起的严重损害的作用机理未完全阐明有关”,尽管其发病机制未完全阐明,一般认为细菌及其毒素促发机体产生的过度炎症

27、反应可能具有重要作用。本文将就作用机理及内毒素血症防治的研究现状作一概述。.结构特点及其作用原理是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖成分,具有广泛的生物活性。宿主细胞对的应答是一个复杂的过程,涉及多种靶细胞、多种细胞受体以及多种细胞因子。近年来,这一领域研究取得了突破性进展,认识到的受体及其相关调节蛋白在机体炎性细胞识别、应答中的关键作用。通过与受体结合将信号传导至单核/巨噬细胞等宿主细胞,从而诱导细胞活化,产生并释放?【、一等促炎细胞因子,这些因子进而诱导其他内源炎症介质释放,引起机体炎症反应。目前普遍认为受体 在结合并介导其信号转导中起关键作用。脂多糖结合蛋白,既可以与结合,又可以同受体结

28、合,它在诱导细胞活性中具有十分重要的意义。.结构特点:由三部分组成:一特异性侧链;核心多糖;类脂。一特异性侧链由个重复单位组成,每个重复单位由?个糖分子组成。它是细菌表面的重复抗原,决定型的特异性。核心多糖可分为连接。一特异性侧链的外核部分和连接类脂的内核部分。核心多糖相对稳定,同一菌属结构相文献综述级中国中医研究院中药所硕士学位论文同。内核部分含有庚糖和一酮基一一脱氧辛酸两种特殊的糖类分子。它们在结构中起着连接多糖与类脂的作用。类脂由个葡萄糖脂、磷酸盐和一定量的脂肪酸组成,为分子中最稳定的部分;各类革兰氏阴性细菌均相同,它是的主要毒性成分。目前认为在中只有类脂和具有毒性。的共同抗原在类脂/如

29、区,常被一特异性侧链遮盖而处于隐蔽状态“”。.与、:年等在血浆中发现了一种能与结合的蛋白,将其命名为“。是一种糖蛋白,分子量为× ,肝脏是其合成的主要来源。在肝细胞内合成的是× 的前体形式,分泌到血液中即成为分子量为×的糖蛋白。在正常血清中的浓度在. /之间,但在急性炎症反应或脓毒症病人中,其水平可升至一 /”。可以与结合,也可以与结合。与的结合部位是疏水端的类脂,它们的亲合力为。并不能与形成稳定的复合物,而且巨噬细胞也不能识别覆盖在红细胞表面未和结合的,提示与结合后可引起的交构,然后才能被识别“。等克隆了人的端的个氨基酸,结果证实与的结合位点在端,与的结合位点在

30、端“”。是一种分子量为的糖蛋白,主要分布于单核/巨噬细胞及中性粒细胞的膜表面。以糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜表面的为,血清中也有以可溶性蛋白形式存在的,它缺乏锚。主要功能是作为受体,介导髓细胞识别、结合,诱导细胞活化,使细胞分泌一。【、一等细胞因子。 及等学者通过构建突变体并结合使用多种抗单克隆抗体,发现存在两个独立的区域,即结合区和信号转导区,的这种结构使其具有结合及激活细胞的双重作用。当结合区突变后,便失去了与特异性结合的能力,更不能介导细胞对产生应答;而当信号转导区突变后,仍可与结合,却不再能介导由诱导的细胞应答?”。近年来的研究表明,/系统具有增敏内毒素的作用。人们发现在文献综述级中国中

31、医研究院中药所硕士学位论文介导的细胞应答过程中,在催化下,每分子仅与?个分子结合“”。对于表达的细胞,存在时用/的即可刺激细胞的反应;对于不表达的/小鼠前细胞,这需用/的才能激活细胞应答。当向/小鼠前细胞转入编码人的基因后,刺激细胞反应所需的量下降了倍“”。人转基因小鼠模型中外周血单核细胞高水平表达,对敏感性高于对照组小鼠”;而基因敲除的小鼠这对引起的休克具有高度的抵抗性“”。在水相中易形成聚集体,单体向自发扩散速率较低,在此过程中可通过形成?复合物而促进与结合,提高细胞对的敏感性。提示在此过程中起一催化剂的作用。与结合后,可启动细胞内信号级链反应,并诱导核因子?转位,从而调节多种细胞因子的产

32、生和释放。的许多效应是通过/介导的。通过/系统可直接诱导人单核细胞产生氧自由基,它在炎症反应中可造成组织损伤。等发现引起氧自由基的释放呈时间和剂量依赖性,当浓度为/时反应达最高值。在不合血浆的缓冲液中,尽管浓度高达/,也不能引起氧自由基的释放。加入可获得与血浆同等的效应,应用抗抗血清或抗抗体则可阻断氧自由基的产生。正常血清可增强刺激一氧化氮的合成,抗抗体则可部分阻断的合成,提示在其中起着一定的作用。纯化可代替血浆增强人和兔肺巨噬细胞对光滑型和粗糙型的反应。当存在时,刺激合成的阈值下降倍,用和一同处理的兔肺巨噬细胞,其【的表达较单用刺激出现早、峰值高、半衰期长,抗的单克隆抗体则可明显抑制刺激细胞

33、产生的能力”。目前认为的毒性作用,主要是通过/途径实现的。高剂量可通过/非依赖途径活化细胞。人们研究发现除外存在另一个”识别分子,它辅助共同介导信号转导?。目前有关下游的信号转导机制尚未完全阐明,这是当前内毒素研究的一个热点。近年来的研究支持蛋白酪氨酸磷酸化在通过/途径诱导细胞活化中起重要作用。等研究发现非受体蛋白酪文献综述级中国中医研究院中药所硕士学位论文/”可与关联。作用于单核/巨噬细胞可迅氨酸激酶家族成员这激活/”“。蛋白酪氨酸激酶抑制剂可完全阻断由诱导的?与?的产生“。蛋白酪氨酸激酶的下游效应酶磷脂酰肌醇一一激酶一一通过其调节亚单位的两个功能域与活化的 /”“关联而被活化,此过程依赖。

34、一一活化后可致磷脂酰肌醇,一三磷酸【,水平迅速增高,而后者具第二信使功能,有可能参与信号转导“”。在诱导的单核/巨噬细胞中,活化的酪氨酸激酶下游还可观察到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化,如丝裂原活化的蛋白激酶的活化。与结合后,可使细胞内磷酸化。豫的活化需要其上游激酶激酶使其”。与”两位点磷酸化。豫的发现为信号级联反应提供了新机制?。.释放与炎症反应早在一个世纪前,和就发现梅毒患者用汞剂治疗后?可出现发热等症状加剧的反应,称为雅一赫二氏反应。自五十年代以来,在抗生素治疗的患者中,因一细菌裂解释放出大量造成临床症状恶化的证据,先后在布鲁氏茵、脑膜炎双球菌和一细菌肠脓毒症的患者中得到证实。自那以后,大量

35、的实验证实,抗生素治疗中可以引起细菌释放,与形成复合物后与单核/巨噬细胞膜表面的结合,激活有关酶系统,促进单核/巨噬细胞合成、分泌多种细胞因子,如、白细胞介素一、一、一、前列腺素、凝血素、干扰素、血小板激活因子等。这些因子适量时可激活免疫系统,产生杀灭微生物的有益作用。过量时可引起机体严重病理生理反应,表现为发热、低血压、心动过速、休克、多脏器功能衰竭及死亡”。“。其中口被公认为引起内毒素休克、等炎症反应的主要因子“”。.不同种类抗生素影响一细菌释放的主要机理.。影响细菌细胞壁合成的抗生素、青霉素结合蛋白与释放传统理论认为,一内酰胺类抗生索的主要杀菌机制是抑制细菌细胞壁的合成。因为这类抗生素都

36、含有一个一内酰胺环,与细菌一乙酰胞壁酸五肽的最后二肽,即一丙胺酰酸相似,能竞争结合转肽酶,形成青霉噻唑酶,使文献综述级中国中医研究院中药所硕士学位论文其失活,转肽过程中止,使细菌细胞渗透压增高裂解而死亡。青霉素结合蛋白 ,是细菌胞浆膜上的一种微小蛋白质,之间。各种细菌谱不同,约种,主要分子量在、,、一、。有有种,按分子量由大到小排序为:一、的还有亚型:如。、。、。等。通过对底物分析,。与肽多糖转肽酶和葡萄糖转移酶活性有关;一。与羧肽酶活性有关。现已明确,实际上是有关粘肽合成的一类催化酶一青霉素敏感酶。数量极少,仅占细胞膜蛋白总量的%,每个细胞只有个分子。个别的性质已比较清楚,如,为一种一羧肽酶

37、,分子量为 。通过一较短亲水肽个氨基酸的羧基端嵌入在胞浆膜上,其氨基端和活性部位向外。每一种与一内酰胺类抗生素作用的详细机制仍不清楚。目前比较重视的是。因为,与细胞快速裂解有关;:和,与细菌的形态改变有关,这些都与释放有关?。不同的抗生素对不同的的亲和力不同,同种抗生素在不同的浓度下对的结合类型也不同。如:伊米配能在倍最低抑菌浓度时,优先与结合,使细菌成为渗透压稳定的大球型细胞,没有裂解;浓度大于倍时,与。亲和力增加,导致迅速裂解。头孢他啶在低浓度时优先与,结合,使细菌变成丝状;高浓度时也与,结合,使细菌迅速裂解。初步认为其作用机理是,。能控制细菌生长和菌体增大,是细菌生长的重要蛋白,主要功能

38、为维持细胞形态,与抗生素结合可致细菌迅速裂解。,能使细菌分裂停止,但不影响生长,故使细菌变成细长的丝状,其长度可达原长度的倍。:的作用机理尚不清楚,可能与维持细胞有关。在一项以头孢他啶与,结合和伊米配能与结合的体外实验表明,头孢他啶引起的释放量大于伊米配能倍。对于这种现象,目前认为与,结合使细菌形态丝状变,能使细菌分裂停止,但不影响生长,随着菌体的伸长含量也不断增加,细菌裂解时,便释放出大量的,其量明显高于与结合的伊米配能的球形变,伊米配能与结合使细菌成球型细胞,因生长停止,含量也不再增加,释放出少量的。兼有上述两种变化的抗生素已在实验室中观察到,如美洛配能在浓度时,与,文献综述级中同中医研究

39、院中药所硕士学位论文结合,引起细菌丝状变,释放较多的,与头孢他啶相似;在浓度倍时,与:结合,出现球形变,释放较少,与伊米配能相似。但多数实验表明,美洛配能主要与结合。同时也证明,伊米配能引起的释放量及由此引起的?【、一等介质的释放量均低于优先与,结合的抗生素,如:头孢他啶、美洛配能、头孢三嗪等”。主要作用于。的抗生素在低于最低抑菌浓度时,仍能诱导大量的”释放而不伴有明显的细菌溶解,此时的释放产生于长丝形成时非溶解性细胞壁损伤”“。.抑制蛋白质合成类抗生素与释放氨基糖甙类、氯霉素类和喹诺酮类抗生素能够抑制细菌蛋白质的合成,导致生长停止、增殖减慢而死亡。因而这类抗生素在多数实验中显示了释放缓慢,释

40、放量较其它种类抗生素低的特性。环丙沙星由于能引起细菌丝状改变,仍可导致大量释放。另外一些研究发现,细菌的外膜表面存在钙、镁阳离子。正常情况下他们起连接与磷脂分子的桥梁作用,能稳定分子。当去除这些离子后,会变得不稳定而释放出来。庆大霉素和环丙沙星可与钙离子络合,引起释放。这种作用能被过量的镁离子所抑制。使细胞成分改变,造成膜的损伤,也是氨基糖甙类抗生素的作用机制之一。一些研究者认为,氯霉素引起的脑膜炎双球菌释放,也是由于细胞膜的损伤,造成膜成分改变,使细菌细胞壁丧失了的结合力所致。环丙沙星引起的细菌丝状改变的机理不明”“?。.干扰细胞膜通透性类抗生素与释放一细菌细胞壁较薄而疏松,粘肽只占细胞壁的

41、%。而含有大量的、脂蛋白和双层磷脂的外膜,其内侧为含类脂质的胞浆膜。多粘菌素等多肽类抗生素由肤键连接的环状高分子化合物组成,结构中有游离的一:和一。带正电的一:与一细菌细胞膜中磷脂上带负电的结合,改变了细胞膜的通透性,使菌体内的氨基酸、核酸、等成分外漏而死亡。中的类脂也含有一,故认为多肽类抗生素具有中和的能力。许多实验已证实多粘菌素作用于一细菡后,仅引起低而缓和的释放。细菌释放出的激活单核/巨噬细胞,促进单核/巨噬细胞合成、分泌多种细胞因子,如?【等,这一作用可被多粘菌素抑制。如在用型嗜血流感杆菌文献综述级中国中医研究院中药所硕士学位论文为模型的动物实验中,单用头孢他啶治疗时,血中的卜【显著增

42、加,加用多粘菌素后便抑制了约%的一。【释放。表明多粘菌素能够中和及减少一细菌释放,因而阻断了由其引起的?【释放。最近发现氨基糖甙类也能结合,但作用明显不如多粘菌素”。”。.内毒素血症防治进展菌血症和内毒素血症是细菌败血症的两大致死状态。强力、高效的抗菌药虽然能有效杀灭入侵的病原体,控制菌血症,但随之而来的大量释放给许多严重感染性疾病的救治造成了极大的困难,目前临床上尚缺乏有效的防治方法。研究表明,抗菌药引起的细菌裂解与其诱导的释放有明显的关系,由于释放出的可溶性比其固着于茵体时的活性要高得多,一旦大量的从菌体释放到血液或体液中,将会产生强烈的毒性反应。有些杀菌性抗菌药如:一内酰胺类抗生素的杀菌

43、作用就是通过影响细菌细胞壁的合成,从而造成细胞壁缺陷,随之导致细菌裂解而实现的。因此,对于这些抗菌药来说,清除菌血症和可能诱导的内毒素血症成为治疗败血症过程中的矛盾。只有将这对矛盾合理地解决,才能降低病人的死亡率。尽管近年来已发现了许多新的拮抗剂,但多数仍停留在探索阶段。另外,随着对抗生素作用机制认识的加深,已经发现一些抗生素具有中和或减少释放的能力。.免疫治疗单克隆抗体,:这类抗体种类较多,主要为和两种,分别针对。一特异性侧链、核心多糖和类脂发挥作用。女口:一、等。其中,较早应用于临床的一由于疗效差,存在严重不良副作用,因而已停用。抗类脂抗体临床应用显示了良好效果,能降低和一【,提高生存率。

44、但对细胞结合型无效。这是因为疏水的类脂位于深部,受一特异性侧链遮蔽。但能结合深部的类脂。这些抗体通过中和、促进单核细胞吞噬及内在化作用发挥了良好的抗作用。但这些抗体只能早期应用,过晚由于一仅已被激活释放,因而不能改善引起的炎症反应”。文献综述级中困中医研究院中药所硕士学位论文联合免疫:由于单克隆抗体仅针对,不能对已产生的细胞因子起”等进行了作用。因而采用多种联合应用,比单一更有效。由一特异性侧链、多克隆抗血清和抗一仅组成的三联免疫动%;物实验。在没有用抗生素的情况下,单用任何一种制剂的生存率为%;种制剂联合应用的生存率为任何种制剂联合应用的生存率为%。.重组中和蛋白重组中和蛋白 ,以鲎制取,对

45、各种细菌的均有高度亲和力。动物实验表明能够显著降低抗生素治疗中的和细菌脓毒症的病死率,其疗效明显高于一”。.拮抗剂为无毒性的红杆菌属外膜中的类脂成分,已由实验室合成。能竞争结合受体,抑制介导的细胞毒作用。动物实验表明,与抗生素联合使用,能明显降低的致死率“”。.粒细胞抗菌蛋白从多形核白细胞的嗜天青颗粒中,已分离出种抗菌蛋白质:杀菌性通透性增加蛋白 ?,;抗菌蛋白 , ;中性白细胞肽,。分子量为 ,具有强大的杀菌、中和和抑制?分泌的能力。 和也有一定的杀菌、中和能力,但对长链型无作用。种蛋白经比较实验,证明它们的作用强度为:远大于,而后者与相同。由于的全部抗菌活性基团位于 区域,因此已人工合成重

46、组 的,即 。经临床实验证明, 能显著降低、一【、一、一和一的水平,减少了中性白细胞脱颗粒作用,因而抑制了引起的生物效应。在周的临床实验期中,任何受试者体内没有出现抗 的抗体,肝、肾、骨髓功能无异常。除了部分受试者有短暂的皮肤潮红外,无其它任何副作用,应用前景十分良好“”。.具有中和、减少释放类抗生素文献综述级中国中医研究院中药所硕士学位论文多粘菌素:由于独特的化学结构,人们已发现多粘菌素具有中和的能力。许多实验已证明,该药单独或与其他抗生素联合应用均能减少的释放。但由于该药抗菌谱窄,有严重肾毒性副作用,因而限制了该药的应用范围。为此,人们已将多粘菌素制成了复合制剂,如:多粘菌素一右旋糖酐、多

47、粘菌素?等。该类复合制剂降低了肾毒性,仍保留了杀菌力和中和的能力“”。新型一内酰胺类抗生素:许多体内外实验已经证实,凡与:亲和力强的一内酰胺类抗生素仅导致较低的释放。已发现的这类抗生素有伊米配能、克拉维酸、氮卓脒青霉素、头孢诺米等。目前证明效果最好的是伊米配能。一项临床对照实验表明,内毒素血症患者,经治疗小时后,伊米配能组的例患者水平已降低;头孢他啶组的例患者水平没有降低,其中例患者的水平增加了。正在开发的新一代碳青霉烯类抗生素一,不需与脱氢肽酶抑制剂联用,杀菌作用更强,副作用更轻,尤其对大肠杆菌,绿脓杆菌,。、:、。显示出强的亲和性。其特性明显优于第一代的伊米配能。而另两种已上市的碳青霉烯类

48、抗生素美洛配能和帕尼配能,主要与,结合,无降低的作用。选用优先与:结合的抗生素,既能杀菌,又能减少的释放,可以提高严重感染性疾病的救治水平”“”“”。内毒素的生物活性广泛,对机体造成严重的损害。由于不同的抗菌药诱导内毒素释放的量不同,因此在抗菌药的研究设计中除了考虑到杀菌效力外,还应考虑到可能诱导内毒素释放的问题。对于败血症病人,在治疗中应采取合理的治疗方案,既能控制菌血症,又要防止或减轻内毒素血症。文献综述级中国中医研究院中药所硕士学位论文溶菌酶的研究进展,具有强力杀菌作溶菌酶,又称胞壁质酶卜种个氨基酸组用, 年由细菌学家首次发现“。它是由成的多肽,分子量为.,广泛分布于生物体内,具有生物相

49、容性好,对组织无刺激、无毒性等优点“”。现就其药理作用及临床应用的研究进展作一综述。.的结构和作用机理的简介年眦”用化学分析法和晶体衍射图像分析法详细探讨了的作用机理,并阐明了、底物和一底物复合物的结构和功能。是一种低分子量、不耐热的碱性蛋白质,其中精氨酸含量最多。它是由 个氨基酸组成的肽链,通过盘曲构成略为椭圆形的立体构性。在构型的中间存在一个裂隙,裂隙的一端与表面相通,是作用于底物的部位。通过酶分子的诱导适应,使与底物结合,形成酶一底物复合物。并对底物发生催化水解。的作用呈相对特异性,它的底物可分为两类:由一乙酰葡萄糖胺合成的壳多糖;由一乙酰葡萄糖胺和一乙酰胞壁酸交替构成的细胞壁粘多肽和低

50、聚糖。两者都由?连接的一乙酰己糖胺残基组成,为纤维素类物质。当显示一乙酰葡萄糖胺酶活性时,它作用于壳多糖类物质。但仅在显示一乙酰胞壁酸酶活性时,才能劈开残基的糖苷键。中间的裂隙长度相当于个呋喃环糖基用、表示的连接,所以它适合水解多糖类物质。在相当于糖基和之间的酶分子上有更活泼的催化集团,位谷氨酸残基上的一和位天门冬氨酸残基上的一,它们位于裂隙的两边,因此对底物的水解作用最适合部位在和糖基连接处。以水解细胞壁粘多肽为例。它劈开残基的糖苷键,导致细菌细胞壁结构破坏。.药理作用.抗茵消炎能直接水解革兰氏阳性细菌细胞壁的粘多肽,最后使细菌崩解。在分泌型、补体参与下,还能水解革兰氏阴性细菌。已经证文献综述级中国中医研究院中药所硕士学位论文实了人类初乳的在、补体的存在下能溶解大肠杆菌菌属。“”通过动物实验指出:在补体存在下,能增加溶菌速度,但不能增加州溶菌活性。此外,它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合,使其失活,并能够增强抗生素和其他药物的疗效,改善组织基质的粘多糖代谢,从而达到消炎、修复组织的目的。.抗感染由于分泌型与的分布基本相一致,因此在机体局部粘膜抗感染免疫中,与均起着重要的作用。并