毕业论文-模拟干旱胁迫对水稻根三种抗氧化酶的影响

1、河南科技大学本科生毕业论文模拟干旱胁迫对水稻根三种抗氧化酶的影响摘 要干旱胁迫是影响植物生长的重要因素之一，是世界农业生产的主要自然灾害。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是禾本科的代表植物，也是单子叶植物的模式植物，具有对环境的变化做出响应的机制，这种机制是在长期进化中建立起来的。对各种生物和非生物胁迫的共同响应均表现出预先指示现象，即通过预处理能够提高水稻对未来这种胁迫的抗性。在此背景下，研究并提高水稻抵抗干旱胁迫的机制已经成为急需解决的关键问题之一。本实验对中花11水稻苗期进行不同聚乙二醇（PEG6000）浓度的模拟干旱胁迫处理，研究了在5、12.5、20PEG6000模拟干旱胁迫下对水

2、稻幼苗根系形态指标的影响、Pro含量的影响及超氧化物歧化酶(SODs，superoxide dismutase)、过氧化氢酶(CAT，catalase)、过氧化物酶(POD，non-specificperoxidase)同功酶活性的影响 。主要结论如下：在PEG模拟干旱的情况下，高强度的干旱胁迫对最长根长有抑制作用，低强度的干旱胁迫对最长根长有促进作用；SOD活性和CAT活性都随PEG浓度增加而增加，随处理时间增加表现出先急剧增加，SOD活性在处理的第2天达到最大值， CAT活性在处理的第3天达到最大值，然后再急剧下降。处理的浓度越高，上升的速度越快，下降的速度也越快。本实验也发现干旱胁迫时水

3、稻幼苗根系POD活性随PEG浓度的增加而增加，因此可以通过测定相同环境下POD的活性来比较干旱胁迫的程度。关键词：干旱胁迫，抗氧化酶，水稻ITHE EFFECTS OF SIMULATED DROUGHT STRESS ON THREE ANTIOXIDANT ENZYMES IN THE RICE ROOT ABSTRACTDrought stress is one of the important factors that influence the growth of plants , is the world's agricultural production is mainl

4、y natural disasters. Rice is one of the world's most important crops , is representative of gramineous plants, monocot plants are also single mode , with a mechanism to respond to changes in the environment , such a mechanism is established in the long term evolution. Common response to various

5、biotic and abiotic stress exhibited the phenomenon of advance directives , which can increase by pretreatment of rice for the future of this stress resistance. In this context , research and improve rice resistance mechanisms to drought stress has become one of the key issues need to be resolved .Th

6、e experiments carried out in the flower 11 different rice seedling polyethylene glycol (PEG6000) concentrations simulated drought stress , the effects of under 5%, 12.5%, 20% PEG6000 simulated drought stress on rice seedling root morphology indicators, contents of Pro and superoxide dismutase (SODs,

7、 superoxide dismutase), catalase (CAT, catalase), peroxidase (POD, non-specificperoxidase) isoenzyme activity impact. The main conclusions are as follows :In the case of PEG simulated drought , high intensity of drought stress on the longest root length inhibition , low intensity of drought stress o

8、n root length up to promote the role ; SOD activity and CAT activity were increased with increasing concentrations of PEG , with increase the processing time showed a sharp increase in first , SOD activity in the first two days reached the maximum treatment , CAT activity in the first three days pro

9、cessing reaches a maximum and then declined sharply. The higher concentrations rise faster , the faster the decline . The study also found that drought stress in rice seedling root POD activity increased with increasing PEG concentration , it can be used to compare the degree of drought stress by me

10、asuring the activity of POD in the same environment .KEY WORDS: drought stress, antioxidant enzymes, riceIII目 录摘 要IABSTRACTII目 录III符号说明V第一章文献综述11.1 植物的抗旱性11.2 聚乙二醇模拟干旱胁迫对植物的影响21.3 干旱胁迫对植物的伤害21.3.1 活性氧的产生31.3.2 活性氧对植物的伤害31.3.3 活性氧的清除41.3.4 干旱胁迫对抗氧化酶及其同工酶的影响51.3.5 干旱胁迫对抗氧化酶基因表达的影响51.4 植物的抗氧化系统61.4.1 超

11、氧化物歧化酶71. 4.2 过氧化物酶71. 4.3 过氧化氢酶81.5 水稻的简介81.6 国内外同类设计（或同类研究）的概况综述91.7 本项研究的目的、意义9第二章 实验部分112.1 实验材料112.2 实验处理112.3 试验方法112.3.1 酶液提取112.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定112.3.3 过氧化物酶(POD)活性的测定122.3.4 过氧化氢酶(CAT)活性的测定122.3.5 根部可溶性蛋白的测定132.4 不同PEG浓度对水稻幼苗根系总长的影响152.5 不同PEG浓度对水稻幼苗生理指标的影响162.5.1 干旱胁迫对水稻幼苗根系SOD活性的影响16

12、2.5.2 干旱胁迫对水稻幼苗根系Pro含量的影响172.5.3 干旱胁迫对水稻幼苗根系CAT含量的影响182.5.4 干旱胁迫对水稻幼苗根系POD活性的影响192.6 讨论20参考文献22致 谢24英文翻译25英文翻译图表部分30III符号说明缩略词中 文SOD超氧化物歧化酶CAT过氧化氢酶POD过氧化物酶PEG聚乙二醇ROS活性氧NBT氯化硝基四氮哇蓝FW鲜重TR处理V第一章 文献综述1.1 植物的抗旱性干旱、盐碱和低温(冷害)是强烈限制作物产量的三大因素，干旱胁迫是一种最普遍的影响植物生产力的环境胁迫1。水资源正成为许多国家制约农业发展的重要因素。据统计，世界干旱、半干旱地区占地球陆地面

13、积的三分之一。在我国，干旱、半干旱地区约占国土面积的二分之一，即使在非干旱地区其主要农业区也经常出现不均匀降水，受到季节性干旱的侵袭。因此，干旱是一种普遍影响作物生产力的环境胁迫。在所有用水量上农业上的用水占总用水量的4/5，干旱胁迫是困扰农业生产的最大因素之一，而占农业用水一半以上的水稻生产更是最受危机的，因干旱而导致的水稻减产每年都会上演2。干旱可分为大气干旱和土壤干旱，长期大气干旱导致土壤干旱。植物在漫长的进化演变过程中，优胜劣汰，逐步发展形成了适应干旱逆境环境的各种有效生理机制。不同植物适应环境变化的方式和机制不同，可以把它们归纳为生化适应、生理适应、形态适应以及生态性适应等，因为不同

14、的适应机制决定了它们抵御和忍耐胁迫的程度也足各不相同的3。环境非生物因子严重制约着植物的生长和发育。对于陆生植物来说制约它们生长和发育的因素不仅来自于干旱和高盐，低温同样制约着它们的生长发育。旱害是指土壤水分缺乏或大气相对湿度过低对植物的危害。植物抵抗旱害的能力称为抗旱性。植物的抗旱性是植物本身的一种能力，不同植物均存在差异，它是植物在水分困乏的情况下保持生长、发育的能力，以及干旱胁迫解除后恢复机体正常机制的能力。整体植物对干旱的适应机制，可以分为三类，包括避旱(drought escape)、御旱(drought avoidance)、耐旱(drought tolerance)。单从植物的抗

15、旱性来说，植物的抗旱能力并不是只包括避旱还有其他的方而，这种能力是御旱和耐旱的统一，是通过多种机制综合作用的结果。陆生植物通常情况下都具有御甲和耐旱这两种特性，但根据不同植物的生理机制不同这两种特性也不尽相同，表现出或强或弱的能力。在水分短缺条件下，营养体小，开花提早株小籽少；雨水充裕，营养生长良好，种子数量明显增加。在长期激烈的生存与环境竞争的过程中，植物体各种器官的形态结构和生理功能地更趋于完善。干旱是这样影响植物的，环境的干旱导致土壤干旱，土壤干旱首先影响到了植物根系的生理活动以及各种代谢，从而影响了整个植株的生长、发育、繁殖。Hsiao等经过研究表明，植物根系生物量的变化直接决定着整个

16、植物存生物量中所占比重的变化，这是鉴定植物抗旱性能力强弱的重要指标之一。从而可以将这些指标作为筛选培育抗旱优良品种的指标之一。综上所述，当植物遭遇干旱胁迫时，其抗旱机制首先通过锁住机体原有的水分的同时最大程度的减少水分的流失，以此来维持体内水分平衡，从而保持住植物体内细胞的膨压不受影响，从而维持植物在一定的干旱胁迫程度下仍然保持正常的生长、发育。多基因控制的复合性状控制着植物对干旱胁迫的应答，并且不同的植物它们的抗旱机制也是不同的，这就是目前研究植物抗旱性所面临的最大困难之一，但是，随着科技的不断发展，技术的不断更新，对于植物的抗旱性的研究不断深入，植物对干旱胁迫适应的机理将会越来越清楚。1.

17、2 聚乙二醇模拟干旱胁迫对植物的影响聚乙二醇(PEG)的分子式HOCH2 ( CH2-O2-CH2 ) nCH2OH，是一种惰性的非离子长链多聚体，易溶于水，溶于水后能产生强大的渗透压，作为一种高分子渗透剂，最大特点是本身不能穿越细胞壁进入细胞质，因而不会引起质壁分离，使植物组织和细胞处于类似于干旱的干旱胁迫之中，因此可以人为的限制水分进入种子的速率从而抑制植物根系的吸水速率。目前，试验室条件下大多采用PEG6000高渗溶液来模拟干旱胁迫，这种方法因具有简单易行，条件容易控制，重复性好，试验周期短等诸多优点，已被广泛应用到蔬菜、花卉、农作物及林木等多种植物苗期抗旱性的早期鉴定。蒋明义等4通过P

18、EG处理水稻幼苗发现，轻度干旱胁迫下SOD，CAT和POD这3种酶活性随时间延长而不断增加，在重度干旱胁迫下SOD，POD仍有上升趋势。朱教君等采用PEG6000模拟干旱胁迫对沙地樟子松种子萌发的情况进行了研究，通过实验的结果表明，采用不同浓度的PEG6000胁迫对沙地樟子松种了的萌发起到了一种缓解的作用；但是随着胁迫强度的增加，种子的发芽率、发芽指数和发芽势表现出明显下降趋势。本文以水稻为材料，采用聚乙二醇(PEG6000)模拟干旱胁迫预处理，研究干旱胁迫对水稻根三种抗氧化酶的影响。1.3 干旱胁迫对植物的伤害干旱胁迫是植物生长过程中最易遭受到的生态胁迫因子，它会使植物因缺水而受伤害，严重时

19、导致植物死亡。它对植物的伤害主要表现产生活性氧等很多方面。在一定的干旱胁迫范围内，植物会通过一些生理生化反应来适应干旱胁迫以保护机制不受伤害，在适度的干旱胁迫下，会导致植物体内有关抗氧化酶的活性升高，从而提高了细胞膜系统的抗氧化能力，这样便可以消除过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子自由基(O2-)等活性氧对植物体内细胞膜系统的伤害，从而使植物抵抗干旱胁迫的能力得到提高。超过了植物自身调节的干旱胁迫，不仅植物会在从表观上受到伤害，如植物的根、茎、叶都会受到不同程度的伤害，同时植物生长、发育、繁殖也会有不同程度的抑制。干旱胁迫会引起细胞气孔的关闭，从而导致光合速率的下降。植物遭受干旱胁迫时，会导致植

20、物叶片相对含水量降低，气孔关闭导致呼吸压力增大，使其净光合速率、气孔导度和蒸腾速率等随着干旱胁迫的程度的增强而逐渐下降，从而使光合作用受到抑制。对干旱胁迫十分敏感的光合作用，是地球上一切生命存在、繁荣和发展的基础。当植物受到干旱胁迫时，首先受到影响的便是气孔，气孔会有一定程度的关闭这样便降低了气孔的导度，气孔导度下降则从而CO2进入植物叶片细胞的量也会减少，这是导致光合作用下降的最根本因素。不同程度的干旱胁迫，对光合作用的抑制也有所不同。轻度干旱时，导致光合速率下降主要是因为气孔导度受到了限制，叶肉细胞间隙CO2以及胞间CO2浓度较低；当植物受到严重的干旱胁迫时，植物体内的代谢发生紊乱，从而导

21、致光合速率下降。干旱胁迫能够使小麦叶片中的PSII质子醌库容量变小、PSII原初光能转换效率、PSII潜在活性受到抑制，干旱胁迫直接影响了光合作用的电子传递和CO2同化过程。植物遭遇干旱胁迫时，植物的渗透势是通过渗透调节的降低而降低的，为了使细胞的生长、发育、繁殖等生理过程保持正常不受伤害，必须维持细胞的膨压不受影响。脯氨酸(Pro)是水溶性最大的氨基酸，在发生干旱、盐渍时，许多植物都积累了高水平Pro，在胁迫适应中起着作用。甜菜碱是存在植物体内一种重要的渗透调节剂，较低浓度的外部的甜菜碱也会对渗透调节又很好的保护作用。当植物遭遇胁迫时在其体内会有甜菜碱的积累，从而应对环境对植物体的伤害，脯氨

22、酸也有同样的机制，而甜菜碱与脯氨酸不同点在胁迫解除以后其叶片和根内的含量下降的趋势不同，由此可以证明甜菜碱的积累可能是永久或半永久性的。甜菜碱的积累水平与植物抗胁迫能力呈现等效的趋势。甜菜碱一方面能够作为渗透调节剂维持细胞膨压，另一方面还能稳定酶和细胞膜结构，清除自由基。1.3.1 活性氧的产生活性氧(ROS)指某些代谢产物及其衍生物，是分子氧部分还原后的一系列比分子氧具有更活泼化学反应性质的氧，这类物质主要有单线态氧(O2)、羟自由基(OH-)、超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)等等。活性氧能够通过很多途径而产生在高等植物的代谢过程。叶绿体、线粒体和质膜上的电子传递至分子氧过程中会产

23、生有害的活性氧。另外，在叶绿体中的某些位点也会产生活性氧。当植物遭遇环境中的干旱胁迫时，最先受到伤害的就是生物膜，当干旱胁迫逐渐增强时，细胞膜会发生膜脂过氧化等一定程度的破坏，从而增加了细胞膜的通透性。为了保护植物体内的细胞免遭伤害，在胁迫后，其体内会启动抗氧化酶系统和非酶促保护系统进行保护。1.3.2 活性氧对植物的伤害当植物长期受到干旱胁迫时，超过了植物自身清除活性氧的能力时，就会对植物本身造成伤害，活性氧的积累通过干旱胁迫而引起，其中蛋白质、核酸等分子被破坏，植物的生物膜受到损伤同时光合作用也会受阻等，这一系列的伤害就会导致使细胞的功能失常，从而导致机体出现各种自由基的伤害。活性氧通过伤

24、害蛋白质的氨基酸残基从而达到对植物的伤害，尤其是Cys、Phe、Trp、Met和Tyr，然后形成羟基衍生物以对植物造成伤害。活性氧能够使蛋白质断裂以及二硫键生成，另外超氧化物导致酶类失活尤其是含金属的酶类，例如作用于羟自由基，会导致磷脂过氧化，同时导致膜脂不饱和度降低，使膜蛋白聚合和交联从何人导致膜流动性降低。羟基自由基具有氧化修饰氨基酸的功能，这样会改变蛋白质的一级结构，由此会影响到蛋白质二级和三级结构，最终造成了蛋白质的伤害。已报道证明一种多蛋白酶复合体能够降解活性氧所破坏的蛋白质并且这种作用是有选择性的。乙烯是通过超氧阴离子的促进而形成的。活性氧通过DNA链的断裂、损伤而对DNA造成损伤

25、，同时另一种途径使DNA损伤和突变是通过对核酸的攻击而形成的，以此来阻断DNA转录及复制；活性氧会引发脂质过氧化及产生脂质氧化物自由基(LO·)、脂质过氧化自由基(LOO·)以及其他一些自由基等，这是活性氧对生物体的另一个很严重的伤害就是对植物生物膜的伤害，对生物膜造成伤害的这些自由基也能够启动脂质过氧化。氧在生物的氧化系统中是一个重要的电子受体，形成不同的氧产物主要是由得到不同电子不同而决定的，如·OH等。NAD(P)H氧化酶在植物体内的能够通过催化NAD(P)H转移电子，从而产生O2，这个反应依赖Mn而完成。另外在还有另一种途径产生O2-，就是通过一些氧化酶、

26、蛋白质和低分了化合物白动氧化而形成，例如醛氧化酶和二氢乳清酸脱氢酶都能产生O2-。含氮氧化合物、高浓度氧、臭氧等不利外界因素也会导致活性氧的产生。植物应对恶劣环境变化的特有的机制即活性氧的形成。干旱对植物最本质的伤害即为活性氧的积累从而导致膜透性增加和质膜损伤。所以研究植物抗氧化酶的活性及其特性对研究植物的抗旱性及其抗旱能力是必不可少的。1.3.3 活性氧的清除植物细胞内活性氧自由基清除的方式是多样的。如通过调节气孔开度、调节细胞渗透压以及启动抗氧化防御系统等来使植物免受干旱的伤害，要使植物免受逆境胁迫的伤害其抗氧化防御系统在这有着重要的作用。植物清除活性氧的清除系统包括非酶促清除系统与酶促清

27、除系统。在正常生理情况下，活性氧的产生与清除是平衡的，因此活性氧是不会在植物体内积累而造成氧化伤害。因此，及时清除机体内的活性氧成分是维持植物正常代谢的重要一环。植物在遭遇外界胁迫时，其体内的各种平衡会遭到破坏，会导致清除活性氧的系统的水平下降，同时活性氧自由基产生增多并且逐渐积累，最终导致自由基的形成从而造成活性氧损伤，最终导致植物体的死亡。植物体内活性氧清除或抗氧化能力的高低，直接由组成酶系统的各种酶活性和非酶系统中各种还原性物质或抗氧化物质含量的高低来决定。对于植物体来说，要使活性氧的清除其体内酶促清除系统有着重要的作用。下面来看植物的抗氧化酶系统，活性氧清除酶系主要是超氧化物歧化酶(S

28、OD)，它能够催化生成O2和H2O2，而可将H2O2转化为无害的O2和H2O的就是过氧化氢酶(CAT)。谷胱甘肽(GSH-R)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化酶(APX)等对清除活性氧也起重要作用。在植物体内存在的抗氧化物质主要有维生素C、维生素E、甘露醇及还原性谷胱甘肽等。这些物质既可作为酶的底物在活性氧的清除中发挥重要作用，同时还能够直接同活性氧反应将其还原。1.3.4 干旱胁迫对抗氧化酶及其同工酶的影响植物在遭受干旱胁迫时，如果胁迫程度超过植物自身所能调节的范围，便会导致植物体内的活性氧产生同时清除活性氧机制失衡，这样就造成活性氧在植物体内的大量积累。非酶抗氧化剂是植物体中抵抗活性

29、氧的一种机制，主要是由一些像谷胱甘肽、氢醌、甘露糖醇这样的有机小分子组成，主要存在于植物的叶绿体和细胞质中。在植物体内参与抗氧化保护反应的酶类，主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX，ascorbate peroxidase)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR，dehydroascorbate reductase)、谷胱甘肽还原酶(GR，glutathione reductase)与非特异性过氧化物酶(POD)等，其中SOD是抵御活性氧自由基介导的氧化损伤的第一道防线，是抗氧化酶体系中的关键酶。Fischer6在很早就提出了关于同工酶的概念，也就是同一生物

30、不同种类不同器官和组织或者不同生物、起源的可作用于同一底物催化相同化学反应，同时在其他方面的性质可以不相同的酶。Mardert和Moller最早用电泳分析法发现了在动物体内含有多种分子形式的乳酸脱氢酶将其称为isozyme即同工酶。为了将其区分开来尤其是从来源上，后来人们把同工酶分为了原级同工酶和次级同工酶：其中原级同工酶是指由编码酶蛋白的基因不同而产生的酶蛋白，而次级同工酶是指由酶蛋白的翻译产物经不同修饰反应而产生的及同一亚基因不同聚合程度而具有不同分了形式的酶蛋白。把其中因编码基因不同但是具有相同功能或者相同作用的不同结构的酶称为同工酶。在高等植物体内同工酶普遍地存在着，这些同工酶有很多具

31、有它们的特异性，这与植物发育过程有关，同时也与外界环境的不同有关。基因存在和表达为同工酶分析提供了有力的依据，很多专家研究了逆境下如冷害、冻害、渗透伤害、重金属胁迫下不同作物POD同工酶谱的不同。孙彩霞7等研究了干旱胁迫下玉米叶片内的SOD、POD、CAT的酶活性和同工酶谱的变化。马峙英8等研究棉花黄萎病抗性时探讨了过氧化物酶同工酶对棉花育种的重要性当其作为遗传标志时。另外，还有很多学者还研究了重金属对植物的胁迫时其叶片抗氧化酶同工酶的变化。1.3.5 干旱胁迫对抗氧化酶基因表达的影响近年来干旱胁迫下植物基因表达的研究日益受到重视，研究表明干旱胁迫能诱导或抑制多种cDNA克隆子、特异蛋白质和m

32、RNA的合成。Bian9等研究干旱和复水条件下牧草不同器官的活性氧和抗氧化酶的变化及抗氧化酶基因的表达模式，表明干旱胁迫抑制了叶中Fe-SOD、Cu/Zn-SODs和根中Mn-SOD基因的表达，并且复水后其基因表达得到恢复，表明在转录水平上SOD同工酶的这个机制在一定程度上能够保护干旱胁迫导致的氧化损伤。由此可以推测抗氧化酶同工酶的活性及其基因表达是有差异的，可能是相互协作的结果。同时在整个处理过程中，无论是根还是叶中的CAT同工酶的表达均没有什么太大的区别。在干旱胁迫下，SOD同工酶和CAT同工酶的表达在同种植物的相同部位的响应不相同。POD同工酶的表达受多种因素影响，其编码基因由一大类称之

33、为超级基因家族的Px基因组成。孙静和王宪泽10研究盐胁迫对小麦POD同工酶基因表达的影响表明，经盐胁迫后，无论是在小麦根中还是叶中POD同工酶的变化均是显著的，由此可以说明盐胁迫明显的影响了POD基因的表达。同时盐胁迫下小麦根的POD酶的5个同工酶(Px-1、Px-2、Px-3、Px-4、Px-5)14个等位基因的表达均存在不同的影响，有些基因的表达具有组织器官特异性，而另一些基因只有在盐胁迫下才表达。盐胁迫下POD酶同工酶基因的表达发生了变化，这说明小麦遭受盐胁迫后会通过控制基因的表达达到抵抗盐渍侵害的作用。高明君11研究盐胁迫对番茄过氧化物酶同工酶基因表达的影响，证明了在纳入研究的等位基因

34、中，几乎一半的基因表达被盐胁迫所诱导，在植物正常生长发育过程中不表达，当它们遭遇盐胁迫时便会表达出来，形成盐诱导同工酶。不同时期不同程度的渗透胁迫处理后基因表达不同，即渗透胁迫下基因表达受胁迫程度、处理时间的影响。在盐胁迫时小麦某些基因转录水平叶中低于根中，说明盐胁迫可引起小麦叶中部分基因转录、表达水平的下降。卢太白12等通过研究小麦过氧化物酶的特异表达与遗传转换模式及转录间的关系，结果表明影响同工酶基因表达信号的差异主要是mRNA转录本数量的差异，不同mRNA转录本决定同工酶基因表达过程中的转录水平。胁迫下转录模式分析表明，水稻CAT同上酶基因分别受到胁迫诱导而显著增加，表达均强于对照水平，

35、在叶中的表达均高于根，存在组织差异性；CAT1与CAT2存在较细微的表达差异：在叶与根中，CAT1基因表达的水平均高于CAT2；CAT1在叶中的表达量最高，在根中的各处理中表达量几乎一致。CAT同工酶基因的转录表达存在差异，表明同工酶对维持细胞进行正常的生理代谢具有不同的特点，用以适应胁迫所造成的压力，转录水平的降低，是细胞受害的间接表现。1.4 植物的抗氧化系统植物的抗氧化系统在缓解胁迫方面起着重要的作用，是植物生理学的研究热点，它可清除植物体内的ROS，以避免过量ROS对植物的伤害。植物的抗氧化系统由抗氧化酶类和抗氧化物质即抗氧化剂类组成。抗氧化酶类包括对ROS起直接作用的超氧化物歧化酶(

36、SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)以及范围作用较广的过氧化物酶(POD)，还包括维持抗氧化物质还原性所必须的酶类即抗坏血酸(AsA)-谷胱甘肽( GsH)循环酶类等，如谷胱甘肽还原酶(GR),脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)等。 抗氧化物质主要包括AsA和类胡萝卜素(Car)以及一些含巯基的低分子化合物(如还原型GsH)等，它们可以通过多条途径直接或间接地清除ROS，又可作为酶的底物而扮演重要角色。通过抗氧化系统的协调作用使ROS在植物体内维持在较低水平，从而使植物进行正常的生长和发育。1.4.1 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD

37、)在整个植物的抗氧化酶促系统中组成了植物体内抗氧化胁迫的第一道防线，在清除ROS方面发挥着重要作用。SOD催化2个超氧自由基发生歧化反应形成O2和H2O2, H2O2再被POD、CAT、APX、GR等抗氧化酶催化清除。作为诱导酶，SOD活性受底物O2-浓度的影响，干旱胁迫下超氧阴离子(O2-)的产生增多，从而诱导SOD活性的增强。不同程度干旱胁迫前期的苹果叶片SOD活性大幅度上升，上升幅度为严重胁迫>中度胁迫>轻度胁迫，严重胁迫时SOD失活13。大量的实验研究表明，随干早胁迫强度的加强和处理时间的延长，大多数植物体内SOD活性先升高后下降，轻中度胁迫下缓慢上升而重度胁迫下迅速上升。

38、复水后随时间的延长SOD活性有不同程度的恢复，SOD活性下降可能是改变了细胞膜保护系统，也可能是保护膜受到了严重损伤而丧失了保护功能14-17。而李建梅等18在转基因甘薯上的研究发现，随着干旱胁迫时间的延长SOD活性下降后上升，复水后开始下降。1. 4.2 过氧化物酶把植物体过多的H2O2还原为H2O和O2的主要是过氧化物酶(POD)，从而解除活性氧对植物的危害。在植物体内POD的活性与其所受胁迫的时间有关，最初胁迫时为了使植物体免受H2O2的毒害，POD能够清除植物体内的H2O2。随着胁迫的增加，POD活性的逐渐升高，这在一定程度上减轻了活性氧对细胞膜的伤害，从而保护植物体不受伤害。胁迫到后

39、期时POD参与活性氧的生成，并能引发膜脂过氧化作用。POD是植物抵抗外界胁迫产生的自由基防御系统中的重要抗氧化酶之一，POD同工酶被称为植物的逆境蛋白。石晓华19等研究棉花叶的POD同工酶在干旱胁迫条件下的变化，表明干旱胁迫后棉花叶的POD同工酶不仅谱带颜色的深浅有变化，而且谱带的条数也有变化，如酶分子Rf=0.25，在轻度、中度干旱胁迫条件下其颜色加重活性升高，而在重度干旱胁迫下谱带的颜色越来越浅活性降低；而另一些酶分子如Rf=084和Rf=014，随着干旱胁迫时间的延长越来越强或是出现的新谱带。李娟等研究干旱胁迫下白术POD同工酶的变化，发现白术叶片的POD同工酶的活性及酶带数日随干旱胁迫

40、的加剧而升高和增多，但过度干旱胁迫时酶的活性有所下降且酶带的数目有所减少。干旱胁迫后其叶片中检测出正常条件下未表达的酶带，这表明白术在干旱胁迫下诱导体内基因编码的新的POD同工酶，以清除由于处在不利生态环境下体内产生的过多的活性氧从而减轻植物体自身的伤害。但过度的干旱胁迫会导致某些酶带活性降低甚全消失，这可能是由于严重的水分亏缺达到植物的最低耐受底限，植物体内的防御机制遭到破坏，POD同工酶失活。Zhang等20研究抗性和感性小麦在干旱胁迫下POD同工酶的变化中发现，干旱胁迫下小麦产生三种POD同工酶。在抗性品种中，POD-1和POD-3酶带的活性较高，却未发现POD-2的酶带，而在感性品种中

41、POD-2酶带的活性在整个胁迫过程中不断的增加，但未发现POD-1、POD-2的酶带。无论是在哪个品种，干旱胁迫后POD同工酶的活性都是增加的，并且复水后同样增加。由此可知同种植物的不同抗性品种在干旱胁迫下其POD同工酶的变化是不同的。郭红祥、尹钧研究灌浆期间籽粒和萌发期种子时发现中转基因POD和CAT活性均低于非转基因小麦21。赵俊杰等用离子束处理小麦根中的POD同工酶多了Rf值为0.47的新酶带，但这条酶带却存在于小麦的盾片中，可能是离子注入引起POD同丁酶基因表达改变的结果22。1. 4.3 过氧化氢酶过氧化氢酶(CAT)同过氧化物酶(POD)一样它的主要作用也是清除氧代谢。产生的H2O

42、2以及由此产生的有机过氧化物ROOH，可以改变氧化损害，并且CAT的活力越高，H2O2增加的比例越小。干旱胁迫下CAT活性的下降，一方而可能是由于H2O2的积累使其失活，另一方面可能是发生了光失活23。目前发现CAT有CAT1、CAT2和CAT3三种同工酶，主要存在于过氧化物体、乙醛酸循环体和细胞质中24-25。有研究表明干旱胁迫能够诱导小麦产生三种CAT同工酶，不同的品种中不同的同工酶对干旱胁迫的敏感度不同，但是CAT1对干旱胁迫最敏感，其活性随着胁迫程度的增强而迅速增加，且在复水后继续增加。但是CAT2和CAT3对干旱胁迫不敏感，这说明干旱胁迫时CAT1对H2O2的清除可能起土要作用。邢承

43、华等研究短时间的铁毒胁迫下，水稻叶片通过增加POD和CAT同工酶条带数和酶峰值来防御铁毒害，而长时间铁毒胁迫则会抑制POD和CAT同工酶产生26。陈红等研究得出茄子/番笳嫁接后过氧化物酶条带数逐渐增加，而过氧化氢酶及超氧化物歧化酶酶带数基本没有变化，表明在嫁接体发育过程中，过氧化物酶比过氧化氢酶及超氧化物歧化酶发挥着更大的作用27。1.5 水稻的简介水稻(Oryza sativa)是一种禾本科，单子叶，性喜温湿一年生草本自花授粉植物，是世界主要粮食作物之一。根据生长习性，稻又可分为水稻和旱稻。通常水稻被分为两种即籼稻(Indica rice)和粳稻(Japonica rice)。在中国广为栽种

44、后，逐渐传播到世界各地。我国水稻播种面占各国粮食作物的1/4，而产量则占一半以上。栽培历史已有6000-7000年。我国科学家袁隆平对杂交水稻的研究作出了巨大贡献，被誉为“杂交水稻之父”。水稻所结稻粒去壳后称大米或米。世界上近一半人口，都以大米为食。水稻除可食用外，还可以酿酒、制糖作为工业原料，稻壳、稻秆也有很多用处。而水稻的生产高度依赖于水资源，水资源濒乏严重制约粮食生产安全。全球土地有三分之一。属于干旱或半干旱地区，研究水稻对干旱胁迫适应性及其机制非常重要。在世界经济的发展特别是发展中国家的发展对水资源的需求日趋增加，缺水的情况逐渐加剧的情况下，一方面不断提高水资源管理水平提高粮食生产，另

45、一方面利用生物技术手段有效地提高农作物抗旱能力，为我国粮食生产提供有力的保障，已经成为一个重要手段。中国现在还缺乏具有普遍适用的耐旱水稻品种。研究水稻的抗旱机制可以有效地提高水稻的产量，从而减缓粮食危机对我国的威胁，具有重要的意义。本论文选取了模式植物水稻作为对象研究PEG预处理后干旱胁迫下对其根和叶的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)同工酶及其表达的影响，通过对同工酶基囚的表达特性及其酶的功能特性进行了初步研究，以期揭示SOD、POD、CAT同上酶与干旱胁迫的关系。1.6 国内外同类设计（或同类研究）的概况综述侯立刚28等采用盆栽试验的方法,以耐冷性品种吉粳

46、81和非耐冷性品种长白9为供试材料,通过不同的磷肥施用量,研究低温胁迫下磷营养对水稻质膜透性及抗氧化酶活性的影响.结果表明:施磷后,随着施磷量的增加,2个水稻品种叶片可溶性糖、脯氨酸含量、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性则呈先升后降的趋势.通过对比常温对照发现,低温下适当增磷可明显提高2水稻品种叶片可溶性糖、脯氨酸含量及3种抗氧化酶活性的上升幅度,减缓电解质外渗率和MDA含量的下降幅度.研究还表明,低温增磷对提升非耐冷品种长白9叶片可溶性糖、脯氨酸含量和3种抗氧化酶活性,降低电解质外渗率和丙二醛含量效果更明显.因此,通过体外增施磷肥可明显提高叶片质膜透

47、性及抗氧化酶活性,从而有利于提高水稻的抗寒性能力。卢少云、黎用朝等对干旱条件下3种不同耐旱性的不稻幼苗相对含水量，丙二醛含量及保护酶活性进行了比较研究。耐旱品种超氧物歧化酶活性在水分胁迫下降低幅度较小，不耐旱品种酶活性降低幅度较大。在轻度水分胁迫下耐旱品种地氧化物酶活性提高，不耐旱品种POD活性无变化，3个品种的过氧化氢酶活性均提高，耐旱性越强，活性提高幅度越大。章崇玲、曾国平以3个不同耐旱性的菜苔（Brassica parachinensis L.H.Bailey）品种为试材，研究了干旱胁迫对叶片保护酶活性和膜脂过氧化的影响及其与抗旱性的关系。干旱胁迫条件下，菜苔叶片的电解质外渗率和MDA含

48、量呈上升趋势，叶绿素含量、抗坏血酸含量和SOD活性呈下降趋势，CAT活性表现为先上升后下降。耐旱品种比不耐旱品种具有较高的叶绿素含量和抗坏血酸含量，具有较低的电解质外渗率和MDA含量；耐旱品种的SOD活性比不耐旱品种下降幅度小。轻度干旱胁迫下，耐旱品种的CAT活性上升幅度比不耐旱品种高；重度干旱胁迫下耐旱品种的CAT活性下降程度比不耐旱品种低。耐旱品种的POD活性在干旱条件下先上升而后降低，不耐品种的POD活性处于下降趋势。干旱6d后，耐旱品种的SOD、CAT和POD活性显著高于不耐旱品种。1.7 本项研究的目的、意义水稻具有对环境的变化做出响应的机制，能够对重复出现的非生物胁迫产生响应或适应

49、。对各种非生物胁迫的共同响应均表现出预先指示现象，即通过预处理能够提高水稻对未来这种胁迫的抗性。干早胁迫是非生物胁迫之一，也是对世界粮食安全生产影响最大的自然灾害，我国则是世界上干早灾害最严重的国家之一。为适应逆境，在长期的进化过程中，一些植物己演化出一套适应机制和策略，如通过调节气孔开度、调节细胞渗透压以及启动抗氧化防御系统等来使植物免受干早的伤害，尤其植物的抗氧化防御系统在保护植物免受逆境胁迫方面起着重要的作用，是植物生理学的一个研究热点。高等植物具有复杂的机制使其对环境的变化做出响应，这种机制主要是通过长期进化建立起来的。它们能够对重复出现的生物和非生物胁迫产生响应或适应。从动态发展的角

50、度看，植物与环境的关系就是植物对环境的适应与进化的过程。近年来，国内外专家学者对干旱胁迫后抗氧化酶的研究较多。本试验以单子叶谷类作物中的模式植物水稻为试验材料，研究PEG模拟干旱处理后不同胁迫程度下三种抗氧化酶的差异。通过测定SOD、CAT、POD的活性，研究干旱胁迫对水稻根中这三种抗氧化酶指标的影响以期了解不同强度干旱胁迫对根系的影响，为植物抗逆性的研究打下基础。29第二章 实验部分2.1 实验材料供试的材料为“中花11”水稻品种。于28浸种2-3d，然后置于铺有一层润湿滤纸的培养皿中，30暗中催芽，每天观察是否发芽，待根长至小于0.5cm时将其点播到尼龙网上，尼龙网置于盛有木村B培养液（p

51、H6.5）的塑料盆中。光照培养箱培养（昼夜温度为28/22，光周期为12 h/12 h，空气相对湿度80，光照强度300molm-2S-1），每7d更换一次培养液，至20d（3叶1心期）开始使用不同浓度PEG6000进行模拟干旱处理。2.2 实验处理试验共设3个处理组，每个处理重复3次：T0：用不含PEG6000的营养液培养；T1：到幼苗长至20d时，开始以含5PEG6000（轻度干旱）的营养液进行培养；T2：到幼苗长至20d时，开始以12.5PEG6000（中度干旱）的营养液进行培养；T3：到幼苗长至20d时，开始以20PEG6000（严重干旱）的营养液进行培养。取样时间 ：实验处理阶段共分

52、三个处理组和一个空白对照组，各组从处理当天即开始进行计时，在保持培养条件稳定的前提下培养六天，进行各个指标的测量。平行试验组同时期取样。2.3 试验方法2.3.1 酶液提取称取0.1g样品鲜根，剪碎后放入预冷的研钵中，按1：6加入预冷的提取液（50mM，pH7.8的磷酸缓冲液）和少量的石英砂，充分研磨后，于4下12000rpm离心15min，所得上清即可用于测定CAT、POD和SOD的活性。2.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法。（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml

53、，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30l酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30l PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD总活性 ( Ack-AE

54、)×V/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。2.3.3 过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法。（1） 取两支试管，洗涤后甩干水分。试剂管号（对照）测定管0.05mol/L pH 5.5的磷酸缓冲液2.9ml2.9ml2%双氧水

55、溶液0ml1.0ml0.05mol/L愈创木酚溶液1.0ml1.0ml蒸馏水3.0ml2.0ml总体积7.0ml7.0ml将上述各管立即放入预先调好37 的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。（也可以每分钟读取一次，3分钟内吸光度变化值A ）2.结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 A 470/min·g （鲜重）表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

56、按下式计算酶的相对活性 酶活性（A470·g-1Fw·min-1 ） =A470 × 酶提取液总量ml样品鲜重g× 测定时酶液用量ml2.3.4 过氧化氢酶(CAT)活性的测定（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对

57、照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=A240×Vt /（W×Vs×0.01×t） (u/g min)A240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。2.3.5 根部可溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝法。1.试剂牛血清蛋白；考马斯亮蓝G-250:称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；90%乙醇；磷酸（85%，W/V)。2.标准曲线的绘制（1）0100g/ml标准曲线的制作 取8支试管，按表2-1数据配制0100g/ml牛血清蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，