Wesern Blot共聚焦

1、严严 明明 2013-8-26口腔颌面肿瘤实验室 实验技术培训第六章 免疫印迹实验技术 激光共聚焦技术实验目的实验目的o 检测细胞或组织蛋白中目标蛋白质的表达检测细胞或组织蛋白中目标蛋白质的表达o 表达定位：组织（细胞）免疫荧光表达定位：组织（细胞）免疫荧光 -激光共聚焦激光共聚焦o 表达定量：表达定量：western blotwestern blot技术技术原理原理免疫印迹（免疫印迹（western blotting ）应用蛋白质特异的单克隆抗体或多克隆抗体应用蛋白质特异的单克隆抗体或多克隆抗体检测特异性的目的蛋白检测特异性的目的蛋白 未知蛋白进行未知蛋白进行sds-聚丙烯酰胺凝胶单向电聚丙

2、烯酰胺凝胶单向电泳（泳（sds-page） 转移到固相支持物转移到固相支持物 特异性的抗体检测目的蛋白特异性的抗体检测目的蛋白原理原理 sds-page多肽多肽sds-多肽多肽多肽多肽dtt断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构sds：阴离子表面活性剂（去污剂），断开分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构蛋白质蛋白质迁移率只与多肽的分子量大小有关迁移率只与多肽的分子量大小有关原理原理适用范围和条件适用范围和条件o 检测细胞或组织内目的蛋白质的表达检测细胞或组织内目的蛋白质的表达o 检测细菌、真菌、血清等目的蛋白的表达检测细菌、真菌、血清等目的蛋白的表达o 非原位检测，不能对

3、目的蛋白做细胞定位非原位检测，不能对目的蛋白做细胞定位o 必须有目的蛋白质的特异性抗体才能完成检测必须有目的蛋白质的特异性抗体才能完成检测o 属于半定量检测，需以内参蛋白，如属于半定量检测，需以内参蛋白，如-肌动蛋肌动蛋白（白（ actin），）， gapdh等作为对照等作为对照操作流程操作流程总蛋白质抽提总蛋白质抽提蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定sds-page考马斯亮蓝染色（不可逆）考马斯亮蓝染色（不可逆）检测电泳成功与否？检测电泳成功与否？电转移电转移丽春红染色（可逆）丽春红染色（可逆）检测电转成功与否？检测电转成功与否？抗体抗体western印记印记抗体孵育抗体孵育发色发色/光底物显迹光

4、底物显迹提取提取分离分离固定固定显色显色总蛋白抽提总蛋白抽提 完全性 防降解 保活性 温度温度: 4 方法方法: 机械法 /非机械法 蛋白本身特性蛋白本身特性: 表面蛋白,膜蛋白,磷酸化蛋白 蛋白的保存蛋白的保存: -80,蛋白酶抑制剂蛋白浓度测定蛋白浓度测定o bradford比色法o 测定考马斯亮兰与待测蛋白的结合量o 用已知浓度的标准蛋白质（如牛血清白蛋白bsa)制作标准曲线sds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 一维分离一维分离 分子量不同分子量不同,与电荷无关与电荷无关凝胶制备凝胶制备 分离胶分离胶-积层胶积层胶蛋白前处理蛋白前处理 蛋白变性蛋白变性垂直电泳垂直电泳sds聚丙烯酰

5、胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 -凝胶制备凝胶制备o 根据目的蛋白的分子量及根据目的蛋白的分子量及sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围选择合适的丙烯酰胺分凝胶的有效分离范围选择合适的丙烯酰胺分离胶浓度离胶浓度丙烯酰胺浓度（）丙烯酰胺浓度（）15107.55.0线性分离范围线性分离范围12431668369457212sds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 -凝胶制备凝胶制备分离胶分离胶积层胶积层胶1 cmsds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 -凝胶制备凝胶制备分离胶灌制后,蒸馏水压平界面,且可以隔绝空气分离胶完全聚合后（约30分钟），尽可能排出凝胶上的液体配制积层胶(约1cm

6、),保证高度高度,快速梳子润湿后再放置,防气泡气泡等待凝胶完全聚合完全聚合(40分钟)冲洗梳孔,去除未完全聚合的丙稀酰胺sds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 -蛋白的预处理蛋白的预处理 蛋白测浓度,根据浓度计算上样量，尽量保证每孔上样量相同。 加入sds凝胶加样缓冲液，在100加热3分钟使蛋白变性 上样缓冲液中的dtt易失效，使用前由贮存液中现加加样应柔和，一般小型的bio-rad垂直电泳仪每孔加样最好不要超过20 l ，上样尽量快不加样的孔用上样缓冲液补齐o 电泳装置与电源相连 ,注意正负电极o 电压设置: 积层胶 80v 分离胶 120150vo 目的蛋白电泳至分离胶中下2/3的位置

7、 sds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 垂直电垂直电泳泳 蛋白分子量标准蛋白分子量标准sds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白分子量标准蛋白分子量标准o 用途：电泳中判断蛋白位置，显色后排除非特异性条带o 电泳过程中预染markero 显色后生物素marker，荧光marker电转移电转移蛋白质从sds聚聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持物 固相支持物：硝酸纤维素膜和pvdf膜 电转方法：干转，半干转，湿转转移装置的安装丽春红染色验证电转移电转移 -固相支持物灵敏度和灵敏度和分辨率分辨率背景背景结合能力结合能力材料质地材料质地溶剂耐受溶剂耐受性性操作顺序操作顺序检测方式检测方式使用范围使

8、用范围nc膜膜高低80100 g/ cm2干的nc膜很脆无缓冲液润湿，避免气泡常规染色，可用放射和非放射性检测0.45m 一般蛋白0.2 m 分子量小于20kd蛋白0.1 m 分子量小于7kd的蛋白尼龙膜尼龙膜高低400 g/ cm2软而结实无缓存液润湿不能用阴离子染料低浓度小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白、和蛋白多糖（主要用在核酸检测中）pvdf膜膜高低125200g/ cm2（适合于sds存在下与蛋白质的结合）机械强度高有使用前100甲醇润湿常规染色，与nc膜比较，可用考马斯亮蓝染色，可用ecl检测，快速免疫检测一般蛋白，糖蛋白检测和蛋白测序电转移电转移-电转移方法电转移方法o 湿转法o 条件

9、：300 ma转膜23小时 （室温） 60 ma 转膜过夜 （4）防过热，防气泡！电转移电转移 转移装置转移装置凝胶滤膜whatman 3mm滤纸whatman 3mm滤纸多孔性垫片多孔性垫片阳 极阴 极每层别忘赶走气泡!电转移电转移 注意事项o 拿取凝胶、滤纸和滤膜时必须戴手套，因为皮肤上的油脂和分泌物中组织蛋白质从凝胶向滤膜转移。o 转膜结束后，凝胶可用考马斯亮蓝染色，以便于检查蛋白转移是否完全。尤其是发现转膜失败时，转膜后凝胶的考马斯亮蓝染色帮助寻找失败原因。蛋白印迹蛋白印迹抗体 成功的关键封闭 尽量去除非特异条带干扰 pbst 洗膜 压片显色蛋白印迹蛋白印迹 封闭封闭价廉物美 脱脂奶粉

10、封闭法 10%脱脂奶粉4过夜 夏天 室温不宜过长 冬天 适当延长孵育时间蛋白印迹蛋白印迹 抗体抗体 一抗 关键关键! 兔抗 多克隆抗体 特异性低 容易出条带 鼠抗 单克隆抗体 杂带少稀释: 1:5002000 (根据产品说明书,推荐1:1000) 脱脂奶粉封闭液或pbst稀释孵育条件: 室温2小时 或 4过夜 二抗 1:500010000稀释 pbst 稀释孵育条件: 室温1小时一抗 -二抗 pbst 洗膜时间 15min x 3次 不能偷懒蛋白印迹蛋白印迹 显色e 化学发光法e 荧光发光法 取决于样品、靶蛋白的量、抗体质量，发光检测灵敏度等许多因素 有一定的粹灭时间,注意避光激光扫描共聚焦显

11、微镜激光扫描共聚焦显微镜confocal laser scan microscope激光共聚焦激光共聚焦o 人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mmo 光学显微镜分辨率：光学显微镜分辨率：0.25mmo 电子显微镜分辨率：电子显微镜分辨率：0.2nmo 共焦显微镜分辨率：共焦显微镜分辨率：0.18mmo分辨力：指分辨物体最小间隔的能力分辨力：指分辨物体最小间隔的能力o 分辨力分辨力高高o 用激光作扫描光源，用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速逐点、逐行、逐面快速扫描成像扫描成像o 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，可获得样品不同面内

12、。调焦深度不一样时，可获得样品不同深度层次的图像深度层次的图像。“细胞细胞ct”激光共聚焦激光共聚焦o 共焦显微镜与传统显微镜的区别共焦显微镜与传统显微镜的区别o 更高的分辨率，可获取连续光学切片更高的分辨率，可获取连续光学切片激光共聚焦激光共聚焦confocalconventional激光共聚焦激光共聚焦培养细胞的免疫荧光染色方法培养细胞的免疫荧光染色方法l l 培养细胞用培养细胞用pbs分三次取代六孔板中的培养液分三次取代六孔板中的培养液l l 在预冷的在预冷的4%多聚甲醛中多聚甲醛中4固定固定30分钟分钟l l 在室温下，在室温下，pbs洗去固定液，洗去固定液，5分钟分钟3次次l l 0.1%triton 处理处理10分钟分钟l l 在室温下，在室温下，pbs洗洗5分钟分钟 l l 在封闭液中室温封闭在封闭液中室温封闭30分钟到分钟到1小时小时l l 加入稀释过的两种一抗，置于湿盒中，加入稀释过的两种一抗，置于湿盒中，4冰箱中反应过夜冰箱中反应过夜