生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术ppt课件

1、第十四章第十四章 电泳分别技术电泳分别技术电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极挪动的景象。电性相反的电极挪动的景象。电泳技术指利用电泳景象对混合物进展分别分电泳技术指利用电泳景象对混合物进展分别分析的技术。析的技术。(1)(1)泳动度泳动度u (u (迁移率迁移率):): 带电质点在单位强度电场下的带电质点在单位强度电场下的泳动速度泳动速度不同分子在同一电场中能够具有不同的泳动度不同分子在同一电场中能够具有不同的泳动度 3. 3.:0.02-:0.02-0.20.2 4. 4.电渗：液体对固体支持物电渗：液体对固体支持物的相对挪动的相对

2、挪动支持物为溶液，很少用。支持物为溶液，很少用。 凝胶的聚合反响：Ammonium persulfate (free radical initiator)过硫酸铵 Acrylamide (monomer)Bis(acrylamide) (bridge)TEMED (catalyst):四甲基乙二胺自在基的生成者自在基的生成者凝胶的根本單位凝胶的根本單位: :丙烯酰胺丙烯酰胺交联使聚合产生分枝交联使聚合产生分枝: :甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺协助传送自在基的加速剂协助传送自在基的加速剂Acrylamide Acrylamide 有毒性！有毒性！-(O S-SO )442-2 SO4CH2=CH-C

3、O-NH21211 2核黄素核黄素-TEMED-TEMED系统与过硫酸铵系统与过硫酸铵-TEMED-TEMED系统系统 丙烯酰胺单体聚合过程：聚合反响聚合反响交联剂呵斥分枝交联剂呵斥分枝端点自端点自在基可在基可再延续再延续freefreeradicalradicalBisBis聚合反响聚合反响交錯连結交錯连結自在基构成自在基构成( )( )(%)100%( )Acr gBis gTV ml( )(%)100%( )( )Bis gCAcr gBis gn核酸核酸(RNA)(RNA)n10410415201520n 104105 104105 5-10 5-10n 105-2 105-21061

4、06 2-2.6 2-2.6HClClH不延续系统浓缩效应表示图不延续系统浓缩效应表示图 延续胶与不延续胶延续胶与不延续胶: : 延续胶：胶条延续胶：胶条( (胶板胶板) )的浓度、的浓度、pHpH值、值、组成成份不变组成成份不变 不延续胶不延续胶: :胶条胶条( (胶板胶板) )的浓度、的浓度、pHpH值、组成成份变化值、组成成份变化延续胶的制胶过程与点样过程玻璃板玻璃板 ( (前前, ,后后) )样本梳样本梳间间隔隔条条间间隔隔条条 浓缩胶浓缩胶 分别胶分别胶不延续胶的制胶过程与点样过程玻璃板玻璃板 ( (前前, ,后后) )样本梳样本梳间间隔隔条条间间隔隔条条 电泳凝胶系统的组成：1电泳

5、系統电泳系統pH胶体浓度胶体浓度缓冲液缓冲液上层上层( (负极负极) )缓冲液缓冲液 2样品溶液样品溶液 3浓缩胶浓缩胶 6.9 4分别胶分别胶 胶胶体体 5下层下层( (正极正极) )缓冲液缓冲液 Tris-HClTris-HClTris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5% 7.520% - - - 不延续胶有聚焦样品的作用变性胶与非变性胶：变性胶与非变性胶：变性胶：胶电脉在蛋白量变性的形状下变性胶：胶电脉在蛋白量变性的形状下进展，进展， 主要指主要指SDSSDS变性条件下进展。变性条件下进展。非变性胶：电泳在蛋白质坚持天

6、然形状非变性胶：电泳在蛋白质坚持天然形状下进展，不加变性剂。下进展，不加变性剂。 SDS 在蛋白质外表 均匀敷上 一层负电：SDSboiling变性蛋白质成一线状分子变性蛋白质成一线状分子原态蛋白质原态蛋白质並且均匀带上一层负电荷並且均匀带上一层负电荷非极性尾部非极性尾部极性头部极性头部 三种不同性质蛋白质的电泳比较：三种不同性质蛋白质的电泳比较：Molecular WeightpINative PAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternary StructureX YZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.

7、29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastX YZ-+。n染色染色将薄膜取出后，置于氨基黑将薄膜取出后，置于氨基黑10B10B染色剂重染色染色剂重染色10min10min。n漂洗漂洗将薄膜取出后，移至漂洗液将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗假设干次，至无蛋白区无蓝中，漂洗假设干次，至无蛋白区无蓝黑色。黑色。的、线性的的、线性的pH)pH)。5.5.电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策1).1).低离子溶液中低离子溶液中, ,不同电荷的蛋白质分子间不同电荷的蛋白质分子间会发生相互静电作用会发生相互静电作用, ,添加溶液离子强度添加溶液离子强度可减少这种作用可减少这种作用, ,

8、但会提高电泳时的电流但会提高电泳时的电流, ,使产热更多使产热更多, ,温度升高又促进蛋白质的分温度升高又促进蛋白质的分散散, ,使区带变宽使区带变宽, ,分辨率下降分辨率下降. .因此电泳缓因此电泳缓冲液的离子强度必需控制适当。冲液的离子强度必需控制适当。0.02-0.2M 0.02-0.2M 的离子强度的离子强度离子强度低离子强度低, ,速度快速度快, ,发热低发热低, ,有电渗有电渗离子强度高离子强度高, ,速度慢速度慢, ,发热大发热大电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策2).2).蛋白质分子所带净电荷主要取决于蛋白质分子所带净电荷主要取决于电泳缓冲液的电泳缓冲液的pHpH值值, ,应

9、仔细调整和应仔细调整和控制电泳缓冲液的控制电泳缓冲液的pHpH值值, ,使各组分使各组分分子的净电荷数差别加大分子的净电荷数差别加大. .但极端但极端pHpH下蛋白质会变性失活下蛋白质会变性失活, ,因此普通因此普通控制在控制在pH4.5pH4.59.59.5之间之间; ;电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策3). 缓冲液的种类,浓度和其他电解质浓度影响蛋白质所带电荷的极性和数量,同时还影响蛋白质分子间的相互作用,因此必需根据分别溶质的不同选择适宜的缓冲系统;电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策4).外表活性剂(SDS等)剧烈破坏蛋白质分子间的非共价作用,使蛋白质分子为外表溶剂分子所包围,阻止

10、了蛋白质之间的相互作用,同时也消除了不同蛋白质固有的电荷差别;电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策5).5).控制电泳介质的有效黏度控制电泳介质的有效黏度, ,包包括选择适当的凝胶孔径和添加括选择适当的凝胶孔径和添加能添加介质黏度的物质能添加介质黏度的物质; ;电泳技术问题及对策电泳技术问题及对策6).6).电泳过程发热量的控制电泳过程发热量的控制: : 发热的难题：蛋白量变性发热的难题：蛋白量变性; ;蛋白质区带分蛋白质区带分散散, ,分辨率下降分辨率下降; ;对策对策: :减少发热减少发热: :降低电流降低电流, ,提高电压提高电压; ;提高传热外提高传热外表积表积; ;提高材质的传热系数提高材质的传热系数; ;提高冷却系提高冷却