液相知识讨论

1、1谈谈配管配管联接HPLC各个单元的流路。要是没有它的话，各个单元便连接不起来，HPLC便无法工作。这里就配管时的注意事项等谈一下。配管中所用的部件分为管子和连接器。材质通常采用不锈钢制的，也有特氟隆制的。管子的外径一般为1.6mm的，多数的HPLC厂家的产品有互换性。内径的种类有0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.8mm等，需要根据目的来选择。内径小的管子由于峰的扩展少，因此用于样品通过部分，但因其容易堵塞，故需要加以注意。内径大的管子不易被堵，且加工也简单，但由于死容积大，因此不能用在样品通过部分。下面归纳一下各种尺寸管子的用途。1)内径0.1mm由于死容积很小，因此被用在小径管LC系

2、统的进样器柱之间、柱检测器之间的配管等处。另外也有用作阻力管的，但由于极易堵塞，且加工困难，因此一般多采用下面0.3mm的一种。2)内径0.3mm每1cm的容积大约是0.7ml，加工也较容易，在进样器柱之间、柱检测器之间的配管上最普遍地使用。另外也经常用作背压管，以防止在检测器的槽中产生气泡。也有用在泵进样品之间的。甚至有做为化学反应检测器的反应盘管使用的。3)内径0.5mm这种尺寸多用于化学反应检测器的反应盘管。4)内径0.8mm每1cm有大约5ml的容积，不可用在样品通过的部分作配管。主要用作泵进样器之间的配管，在GPC及制备中经常采用的、通过六通阀上的定量环进样时，也采用此规格的管路。千

3、万要注意的是：不论哪种管子，其外径都完全相同，切勿搞错！当许多人使用同一装置时，应在管子上标注记号。2谈谈手动进样器    进样器有手动式和自动式两种，随着系统自动化的推进，自动进样器已渐趋普及，但作为进样器的主力，恐怕仍然是手动式的，对于手动进样器，我们平时使用时并没有特别留意，但应当指出，如果使用方法不当，也会引起色谱图上出现不良的、标准曲线没有直线性、产生漏液等现象，导致故障。这里以7725型手动进样器为便，谈谈要做到避免故障，正确使用的注意事项。构造7725型进样器的构造如图所示，定子上刻有号码，组装时将附属的排出管接于5号和6号。2号必须与泵联接，3号必

4、须与柱相接。在装填样品(Sample load)的状态(向左旋)下，注入样品，接着进样(向右旋)时微量注射器的针头在定子的表面(由于转子的旋转，定子面用硬质陶磁制成)滑动旋转，与5号排出管路相接。同时转子封垫的二个槽落入样品环路介于泵和柱之间的位置。这样一来，样品按与微量注射器装填(Load)时相反的流向。被送入柱中。操作注入的方法有环路全量注入和部分注入两种。标准附属的环路为20ml，如果用约100ml的微量注射器注入全量的话，则环路被清洗，并且环路被样品完全充满。如果用此方法进样，则属于“环路进样”能保证有20ml样品量注入，这样做重现性较好。这就是全量注入的方法。部分注入的方法是在以环路

5、容量作为最大的范围下，通过微量注射器注入样品进行进样。这一方法虽然微量注射器的计量误差将影响重现性，但也有其有利性，即只要改变注入容量，就可从同一浓度的标准试样中作出标准曲线，故最为普遍使用。不论何种方法，使用7125型进样器时，不必取下微量注射器，转动把手即可进样。为了保持针端的密封形状准确，平时请将微量注射器或附属的针插上。保养由残余样品引起的样品相互污染(Cross Contamination)在进行反复注入时会给工作带来影响。请将附属的聚四氟乙烯制的针口清理器安装在注射器上，以清洗针口。长期使用后，会产生转子处的漏液或开始向其他流路的泄漏。7725型的转子密封是可以更换的消耗品。(转子

6、密封，P/N 670-12098-51)耐性7725型的耐压为350Kgf/cm2。通常这已经足够了，但如有特殊的使用目的，可以通过增紧定子螺栓来达到500Kgf/cm2的耐压规格。不过为延长使用期，仍以在较低耐压规格下使用为宜。7725型的密封材料使用的是称作BESPELÒ的聚酰亚胺，因此不可用于pH10以上的碱性移动相。3关于样品的注入进样器有手动式和自动式的。虽说近来系统的自动化急速发展，但主要使用的恐怕仍然是手动式的。我想很多人都有这样的经历:在用手动式注入试样进行分析时，标准曲线缺乏直线性，在色谱上出现不良的峰，等量注入了同样的试样而色谱峰的重现性却不好。为什么会产生这样的

7、毛病呢？我想以7725型为例，只限于通过进样器的操作，考虑一下其原因及对策。使用说明书上对于注入样品时的操作顺序是这样指示的。在把手柄处于进样的位置(以下称进样状态)时，使用附属的针口清洁器和注射器，注入清洗液(通常为移动相)清洗针口。将把手柄扳到load装填的位置(以下称装填状态)，插入微量注射器。注入微量注射器内的样品。切到进样状态。在进样状态下拔出微量注射器。在这一系列的操作中，是非常重要的操作，这一步如有疏漏，便容易发生上面提到过的毛病。这是由于进样器针口的污染可以认为是故障的主要原因。    请看附图。图1所示是结束上述的操作后之阶段上的针口。如果在微量

8、注射器的针尖上有样品粘附，或在针尖与进样器的定子面之间有间隙，则如红色所示将有样品残留。如在此状态下进行的操作，则残留的样品将扩散到整个针口(图2)。如果在这里省去而移到的操作，则此样品将被挤入样品回路，产生所谓的交叉污染(图3)。因此的操作，即预先洗掉残留样品，这是防止故障的关键。    但是每次注入样品时都必须清洗针口，这又是件非常麻烦的事。有没有多少方便些的办法呢？这里可以考虑的是下面的顺序。进样状态时，插入微量注射器。转换到装填状态，注入微量注射器内的样品。转换回进样状态。在进样状态下拔出微量注射器。与前面方法的不同之处在于：是在装填状态下插入微量注射器，

9、还是在进样状态下插入。如果在进样状态下插入，则即使残留有前次注入的样品，它也将被挤出到排出管方向去，而不会引起交叉污染。这个顺序在进样器的样品回路容量比较小(50ml以下)的时候是十分有效的方法。由于过于注重色谱分析本身的性能好坏，对于注入样品的操作，可能考虑得较为简单，但从数据的可靠性这一观点来看，其实是一项非常重要的操作。如上述那样，只要稍加用心，数据便会大不一样。因此希望各位充分注意。当然，关于试样注入的故障除了进样器的操作以外，还有起因为样品的称量错误及清洗错误，或者样品在微量注射器内壁上的吸咐等，以及微量注射器的操作有误的，关于这一类故障，希望在另外的机会里再作一说。 7有

10、机溶剂的优与劣在HPLC中最为频繁地使用的有机溶剂是甲醇和乙腈。(这两者主要在反相色谱分析中使用)，有时候使用优级的，但最好当然不是使用HPLC级的。与优级相比，HPLC级的更多地除去了会吸收紫外线的杂质。因此从检测、柱劣化等方面来看，HPLC级的更为理想。从检测上说无论如何需要HPLC级的情况可以分为两种。第一种情况是需要作微量检测，因此需要尽最大可能降低基线噪声。第二种情况是根据gradient梯度洗提法进行分析时。前者是因为有机溶剂中的杂质会使基线噪声增大，所以越是等级高的便越理想。作为后者的一个例子，我们设想一个进行A、B两液(step)阶段梯度洗提法的情况来看看。当A液中含有会吸附于

11、柱中的杂质时，在A液流动的过程中杂质将浓缩在柱内。从而会出现这种现象：在其后切换到洗提力强的B液时其杂质被当作波峰观测，带来基线变动，引起测定障碍。    关于第一种情况，只要取得有机溶剂的紫外吸收光谱，就可以了解到在检测波长方面，采用了HPLC级的时候和采用了特级的时候，噪声程度有多少的不同。    图1是HPLC级甲醇与优级甲醇的比较。图2是乙腈的优级与HPLC级的比较。图3是吸附色谱分析中多采用的已烷的优级与HPLC级的比较。各图中虚线是优级，实线是HPLC级的。甲醇在测定波长区域中未见有太大的差别。乙腈在短波长区域呈现出很大差

12、别。乙烷在短波长区域也能看到差异。参照这些图，对于在以某个波长测定之际判断应使用哪一种将会有所帮助。此外，尤其是在GPC中经常使用的有机溶剂中有THF(tetrahydrofuran)。在一级的THF中作为过氧化物抑制剂含有BHT(butylated hydroxy toluene)。因为BHT有紫外吸收，所以会引起噪声程度加大。HPLC级中不含BHT。使用紫外吸光度检测器时建议使用HPLC级的。三氯甲烷在GPC中也常被采用，但请注意有些等级的作为稳定剂添加有少量的乙醇。使用有机溶剂时，请参考本文所叙，选择符合分析项目中溶剂的等级。13予处理柱和防护柱在HPLC中说的“柱”有分析柱、前处理柱、

13、予处理柱(Proecolumn)、防护柱(Guardcolumn)等各种名称的柱。这当中予处理柱、防护柱的使用是以保护分析柱为目的的。予处理柱和防护柱的名称用语有时候混用，这里将其区别开来解说。    予处理柱和防护柱有什么区别？    请看附图。予处理柱被设在泵进样器之间，只通过移动相。而防护柱被设在进样器分析柱之间，通过移动相和试样溶液。    为什么必须要有予处理柱呢？予处理柱在HPLC出现的当时，主要是为了使“液相涂层柱”的固定相饱和的，当然现在这一目的基本上已不再使用了。使用予处理柱的目的在于清

14、除移动相中的不溶解物质或不纯物质，在使用容易使填料劣化的移动相之时保护分析柱。首先来看一下，所谓移动相中所含的不溶解物质、不纯物质究竟是些什么呢？HPLC的移动相中使用各种试剂，其中会混有一些不溶解物质或不纯物质。多数不溶物通过用膜滤器过滤移动相可以除去，但极细小的粒子会穿过过滤器。此外在移动相调制之后，还有从空气中或容器、人体等处有不溶物、不纯物落入的可能性。这些不溶物、不纯物根据不同的分析目的，会污染柱、或使堵塞、或给分析带来不良影响等。例如在离子色谱分析中对无机的1价阳离子作分析之时，按其移动相条件多价阳离子不被洗提。因而会出现移动相中所含的微量多价阳离子不断被填料所捕集掉，1价阳离子的

15、保持变得快起来的情况。这时通过安设离子更换容量大的予处理柱Shim-pack IC-PC1可以防止其产生。或者另外在用后柱(Postcolumn)衍生化法分析氨基酸之际，移动相中的氨会带来基线的变动，经常妨碍峰的检测，这也可以通过装设捕集氨的予处理柱(Shim-pack ISC-30)得到上述情况的减少。前面说到予处理柱对于容易使填料劣化的移动相能起保护分析柱的作用，这方面的例子可以考虑有在反相色谱分析中采用硅胶系填料，向移动相中添加高浓度的缓冲液或胺类的场合，采用碱性移动相的场合等。我们知道这类移动相硅胶载体将慢慢地溶解。正因如此，才通过安装填入了硅胶系填料的予处理柱以抑制分析柱的劣化。&#

16、160;   为什么必须有防护柱呢？防护柱作用为预先捕集将被分析柱牢固吸附，不能被流动相所洗涤的物质。防护柱的填料通常使用与分析柱相同之物，但如果清楚地知道想要捕集的成分的话，也不一定拘于此点。内径不要超过分析柱，长度有12cm左右就足够了。这是由于分析柱的损伤在多数场合只是分析柱入口侧的一小部分填料。建议如上述有效地利用予处理柱、防护柱，以延长分析柱的寿命。12柱的维护保养HPLC取得了惊人的发展，这其中新型高性能填料的出现是重要的因素之一。也就是说HPLC基本上是“分离”手段，因而可谓是分离所需之心脏部分的柱的性能首先必须良好。    日常

17、使用HPLC，会意外地遇上可以认为是由柱引起的故障。根据使用方法不同，柱有时会工作很长时间，有时很快就出现不良情况。这里就柱的维护保养谈一下。    将柱的维护保养归纳一下，可有以下这几条。    a) 试样必须过滤！    b) 谨防柱受污染！    c) 柱务必清洗干净！    d) 柱须轻拿轻放！    e) 确认移动相的制约！    f) 依不同目的分别用柱！ 

18、0;  g) 须注意保管方法！下面就各项内容再作些详细叙述。a)一旦试样液中的不溶物进入柱中，将会引起入口过滤器及填料的堵塞，柱压上升，有时便会破坏分离。试样希望以尽可能清洁的状态注入。不论在什么情况下，都请留意用0.5mm左右的过滤器过滤一下试样液。最近，市场上有许多HPLC用的、使用方便的过滤器出售,如果利用这些过滤器，则将很方便。b)有时即使将试样液作了过滤，仍然会发生柱堵塞、被污染等情况。这里的原因可以考虑有因试样中存在的夹杂物使溶解性差的成分向移动相析离、被填料牢固保持的夹杂成分的吸附、微型注射器的污染等。不论如何，最好是在柱的前面将这些污染尽可能地除去，不让其往柱中发展。

19、为了这个目的，设有予滤器和防护柱。予滤器中装有孔径为1mm左右的滤网，可帮助除去将引起堵塞柱的物质。防护柱是安装在分析柱前面的短柱，具有捕捉牢固地吸附于填料上的夹杂成分的作用和予滤器性的作用。防护柱所用的填料，只要是和分析柱相同的便可，但在用二氧化硅系时，为了更加简便且便宜地制作防护柱，可以使用直径3050mm左右的。而在合成树脂系时，多采用同一填料。此外，根据目的不同，也有采用与分析柱不同种类的防护柱。如果将予滤器和防护柱两个都装，则大可放心，但必须充分注意在这些部分上的峰扩展。c)上面说到防护柱能清除污染，但这个作用是有限的，不可过于相信。它能清除的只是牢牢地吸附在它上面的成份，使用时应有

20、这个意识。因此柱在使用之后，当然依试样不同，需在每几次分析样品之后进行一次清洗。    d)柱中填满了数mm大小的细小粒子。不可使柱受冲击。另外应避免压力的急剧变化，以防损伤柱。e)有时会因移动相的pH、有机溶剂量等受到制约，因此请充分确认之后再使用。f)一旦将一支柱用于各种分析，则有时前面的数据会不再重现。此外，如果重复进行移动相条件差别较大的分析，则会加速柱的劣化。即使是相同种类的柱，看来也是以根据分析对象不同分开备用为上策。另外请务必做好各个柱的使用记录。g)基本上只要用柱启用之前(新的)封入的溶剂封入后保管就可以了，用缓冲液等应经常重新封入，保管场所要求震动少，不会产生高温。最后就柱的故障中相对较多的现象及其处理来谈一下。请看附图。    图上排列着注入了某种成分的色谱图。以作为新柱时的色谱图。在作用过程中，如所示在峰根部开始出现拖尾，再继续用下去，便象那样,所示变成了两个峰！在这种时候请