材料研究方法

1、近红外光谱技术在药物分析中的应用摘要： 近红外光谱技术(NIR)是一种高效快速的现代分析技术，它综合运用了计算机技术、光谱技术和化学计量学等多个学科的最新研究成果。自上世纪80年代以来，随着计算机技术和化学计量学的迅速发展，近红外光谱在各领域中的应用研究蓬勃展开。并已逐渐得到大众的普遍接受和官方的认可。鉴于其分析速度快、分析效率高、非破坏性、分析成本低、无污染、不需预处理、操作方便等特点，至今，已在制药工业获得广泛的应用。关键词：近红外光谱法，定量分析，偏最小二乘法，化学计量学1近红外光谱技术概述1.1近红外光谱技术的发展历程 近红外光谱技术(NIR)是一种高效快速的现代分析技术，它综合运用了

2、计算机技术、光谱技术和化学计量学等多个学科的最新研究成果，以其独特的优势在多个领域得到了日益广泛的应用。并己逐渐得到大众的普遍接受和官方的认可。近红外区域按ASTM定义是指波长在780一2526nm范围内的电磁波，是人们最早发现的非可见光区域l。NIR光谱主要来源于含氢基团X一H的伸缩、弯曲和剪切等振动的倍频与合频吸收，谱带重叠严重，特征复杂，吸收信号弱。NIR发现后，由于物质在该谱区的倍频和合频吸收信号弱，谱带重叠，解析复杂，受当时的技术水平限制，近一个半世纪近红外技术几乎处于停滞不前的状态。直到20世纪50年代，随着商品化仪器的出现及Norris等入所做的大量工作，使得近红外光谱技术曾经在

3、农副产品分析中得到广泛应用。到60年代中后期，随着各种新的分析技术的出现，和经典近红外光谱分析技术暴露出的灵敏度低、抗干扰性差的弱点，使人们淡漠了该技术在分析测试中的应用，从此，近红外光谱进入了一个沉默的时期。80年代后期，随着计算机技术的迅速发展，带动了分析仪器的数字化和化学计量学的发展，通过化学计量学方法在解决光谱信息提取和背景干扰方面取得的良好效果，加之近红外光谱在测样技术上所独有的特点，使人们重新认识了近红外光谱的价值，近红外光谱在各领域中的应用研究陆续展开。进入90年代，近红外光谱在工业领域中的应用全面展开，有关近红外光谱的研究及应用文献几乎呈指数增长，成为发展最快、最引人注目的一门

4、独立的分析技术。由于近红外光在常规光纤中具有良好的传输特性，使近红外光谱在在线分析领域也得到了很好的应用，并取得良好的社会效益和经济效益，从此近红外光谱技术进入一个快速发展的新时期。无论是在定性方面还是定性方面，在食品、医药、石油工业、高分子领域等各个领域都得到了很好的应用，并且在在很多领域利用近红外光谱的标准方法以及接近成熟。1 .2近红外光谱分析技术的基本原理 物质的近红外光谱包含了组成与结构的信息，而性质参数(如油品的相对密度、馏程和闪点等)也与其组成、结构相关。因此，在样品的近红外光谱和其性质参数间也必然存在着内在的联系。使用化学计童学这种数学方法对其两者进行关联，可确立这两者间的定量

5、或定性关系，即校正模型。建立模型后，只要测量未知样品的近红外光谱，再通过软件自动对模型库进行检索，选择正确模型，·根据校正模型和样品的近红外光谱就可以预测样品的性质参数。所以，整个近红外光谱分析方法包括了校正和预测两个过程。NIR光谱技术是借助于近红外光照射到目标分析物后，对经反射或透射而得到的光谱进行定性或定量分析，从而获得被分析物质的相关信息。NIR光谱分析技术是一种间接分析技术，须利用化学计量学方法来实现光谱数据与目标性能之间的关联，进而分析未知样品。当近红外光照射到物质上时，经物质吸收或反射，就可获得带有物质信息的NIR光谱。NIR光谱是由于分子非简谐振动使其从基态向高能级跃

6、迁时产生的，主要是各种C一H、0一H、N一H等含氢基团振动的倍频及合频吸收，其他官能团，如C-O、C一C和C-N等在该区域仅产生非常弱的倍频跃迁吸收，没有实际分析意义。2-3不同基团在近红外区吸收峰的峰位置及强度有一定的差异，表1-1列出了主要含氢基团在近红外区的谱带归属。物质中不同组分的含氢基团在近红外区域都有特定的吸收特征，这些特征吸收与物质的组成和结构有着必然联系，这为NIR光谱技术进行定量和定性分析提供了理论依据。表1-1主要含氢基团在NIR区吸收谱带的近似归属(nm) 虽然NIR光谱包含丰富的物质组成和结构信息，但由于该区域吸收带较宽且重叠严重，吸收比基频弱，谱带有可能为多个不同基频

7、的倍频与合频的组合，另外样品状态、仪器性能和测量环境等因素对谱带位置和强度也存在一定影响，因此很难对谱带直接进行精确归属或用传统方法进行含量测定。用NIR光谱法进行分析，一般需选用适当的化学计量学方法建立光谱与样品性质之间的关联模型，这也意味着近红外与中红外在样品信息提取和用途上有很大差异。1.3近红外光谱分析技术的特点 与紫外·可见分光光度法、液相色谱法、原子吸收光谱法等传统分析方法相比较，NIR光谱方法具有以下优点: 样品前处理简单。近红外光的穿透能力和散射效应均较强，可采用透射方式或漫反射方式采集光谱，许多样品不需特殊处理即可直接进行分析。 分析速度快。一般采集一个样品的NIR

8、光谱法所需时间小于30s，建立好回归模型后，一分钟之内即可完成样品目标性能分析。 仪器操作和维护简单，对分析人员技术要求低。目前NIR光谱仪一般自动化程度较高，且都带有常用的相关数据处理软件，易于学习和操作。 近红外光在光纤中传输特性较好，因此易于实现远程在线检测。 NIR光谱方法也有以下两方面不足: 物质在近红外区域的吸收较低，因此测试灵敏度低。NIR光谱法的定量分析检测限约为0.001，不适于微量分析。 NIR光谱法是一种间接分析方法，NIR光谱分析前需要标准分析方法提供样品性质的参考值，因此模型性能受标准分析方法准确度限制。另外，建模样品的采集、参考值的分析和模型的建立都需要投入一定的人

9、力和财力，因此不适合于少量样品分析。41.4 NIR光谱分析过程物质的NIR光谱包含了其组成和结构等性质参数信息，但由于NIR光谱谱峰复杂，重叠严重，很难直接找出物质光谱与性质参数之间的关系。NIR光谱分析就是利用化学计量学方法对被测物质光谱数据与目标性能参数进行某种关联，建立分析校正模型。对于待分析的未知样品，光谱数据代入校正模型即可预测其性质参数。NIR光谱技术一般包括校正、检验和预测三个过程，其中校正模型的建立是核心技术。NIR光谱技术的分析步骤如图1一1所示。图1-1中主要分析过程中要注意以下几点:用于建立校正模型的样品的性质参数应涵盖模型需分析的所有样品性质参数，还应该有足够的样品数

10、来提高方法的学习能力。选择权威的分析方法测定样品目标性能参考值。标准方法测量结果的准确性决定着校正模型的预测性能。在NIR光谱采集过程中应尽量保持实验环境一致。根据实际情况对原始NIR光谱进行适当预处理有助于建立预测性能稳定、准确的校正模型。建立校正模型过程中注意对波段范围、数据预处理方法、回归方法的参数进行优化。对未知样品进行分析时应采用与建模样品相同的光谱采集条件，相同的数据预处理方法。图1-1NIR光谱分析流程图2近红外光谱分析中常用的化学计量学方法虽然近红外光谱理论上非常适合用于碳氢有机物质的组成性质测量，但是在该区域内，含氢基团化学键振动的倍频与合频吸收强度很弱，灵敏度相对较低，吸收

11、带较宽且重叠严重，因此，依靠传统的建立工作曲线方法进行定量分析是十分困难的。这也是早期影响近红外光谱分析技术发展的致命原因所在。化学计量学的发展为这一问题的解决奠定了数学基础。5在近红外光谱分析中，常用的化学计量学主要应用在两个方面。即：光谱数据的预处理；定量模型的校正。2.1光谱数据的预处理近红外光谱往往包含一些与待测样品性质无关的因素带来的干扰，如样品的状态、光的散射、杂散光及仪器响应等的影响，导致了近红外光谱的基线漂移和光谱的不重复。所以对原始光谱进行预处理是非常必要的。在近红外光谱分析使用的这些化学计量学方法中，光谱预处理是基础，定性和定量分析都是在此基础上进行的。因此，光谱预处理方法

12、对建立预测能力强、稳健性好的分析模型至关重要，有时甚至起决定作用。6光谱预处理方法主要包括以下几种方法。2.1.1平滑(smoothing)算法 由光谱仪得到的光谱信号中既含有有用信息，同时也叠加着随机误差(噪声)。信号平滑是消除噪声最常用的一种方法，其基本假设是光谱含有的噪声为零均随机白噪声，若多次测量取平均值可降低噪声提高信噪比。常用的信号平滑方法有移动平均平滑法savitzky-Golay卷积平滑法7。采用移动平均平滑法，平滑窗口宽度是一个重要参数:若窗口宽度太小，平滑去噪效果将不佳;若窗口宽度太大，进行简单求均值运算，会平滑掉一些有用信息，造成光谱信号的失真。为此Savitzky-Go

13、lay提出了卷积平滑法。Savitzky-Golay卷积平滑法与移动平均平滑法的基本思想是类似的，只是该方法没有使用简单的平均，而是通过多项式来对移动窗口内的数据进行多项式最小二乘拟合，其实质是一种加权平均法，更强调中心点的中心作用。SavitZky-Golay卷积平滑法是目前应用较广泛的去噪方法，但应注意移动窗口宽度及多项式次数的优化选择。2.1.2导数算法(derivative)光谱的一阶和二阶导数是NIR光谱分析中常用的基线校正和光谱分辨预处理方法。对光谱求导一般有两种方法:直接差分法和Savltzky-Golay求导法。对于分辨率高、波长采样点多的光谱，直接差分法求取的导数光谱与实际相

14、差不大；但对于稀疏波长采样点的光谱，该方法所求的导数则存有较大误差，这时可采用savitzky-Golay卷积求导法计算。Savitsk-Gofay卷积平滑也可用于求取导数光谱，通过最小二乘可计算得到与平滑系数相似的导数系数，可通过查表得到8。导数光谱可有效地消除基线和其它背景的干扰，分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度。但它同时会引入噪声，降低信噪比。在使用时，差分宽度的选择是十分重要的:如果差分宽度太小，噪声会很大，影响所建分析模型的质量;如果差分宽度太大，平滑过度，会失去大量的细节信息。可通过差分宽度与校正标准偏差(SEP)或预测标准偏差(SEC)作图来选取最佳值，一般认为差分宽度不应超过光谱

15、吸收峰半峰宽的1.5倍。2.1.3多元散射校正(MSC)多元散射校正的目的与SNV基本相同，主要是消除颗粒分布不均匀及颗粒大小产生的散射影响。MSC算法的属性与相同，是基于一组样品的光谱阵进行运算的。MSC是由Martens等人提出的，随后在NIR固体漫反射和浆状物透(反)射光谱分析时得到了广泛应用。MSC的具体算法如下: 计算校正集样品的平均光谱x(理想光谱); 将xi与x进行线性回归， 其中，i=1，2，n，n为校正集样品数;1为1 x m的单位向量，m为波长点数。对于校正集外的光谱进行MSC处理时则需要用到校正集样品的平均光谱x，即首先求取该光谱的a和b，再进行MSC变换。对于进行MSC

16、处理的反射光谱单位应为log1PR或Kubelka-Munk形式。因MSC校正假定散射与波长及样品的浓度变化无关，所以，对组分性质变化较宽的样品，MSC的处理效果较差。有文献证明MSC与SNV是线性相关的，两种方法的处理结果也应是相似的。除标准MSC算法外，还存在一些改进变形算法如反向信号校正(ISC)和扩展反向信号校正。但这些方法都不如MSC应用广泛。92.1.4数据增强算法(data enhancement)在使用多元校正方法建立近红外光谱分析模型时，将光谱的变动(而非光谱的绝对量)与待测性质或组成的变动进行关联。基于以上特点，在建立ND又定量戴定性模型前，往往采用一些数据增强算法,来消除

17、多余信息，增加样品之间的差异，从而提高模型的稳健性和预测能力。常用的算法有均值中心化、标准化和归一化等，其中均值中心化和标准化是最常用的两种方法，在用这两种方法对光谱数据进行处理的同时，往往对性质或组成数据也进行同样的变换。102.2定量模型的的校正定量校正也称多元校正，即在物质浓度(或其他物化性质)与分析仪器响应值之间建立定量关联关系，是化学计量学的一个主要分支。多元校正目前仍然是化学计量学中最具有实用性和发展最为迅猛的领域之一。在近红外光谱分析中常用的多元校正方法包括:多元线性回归(MLR)、主成分回归(PCR)和偏最小二乘法(PLS)等线性校正方法，以及人工神经网络(ANN)、拓扑(TP

18、)和支持向量机方法(SVM)等非线性校正方法。其中偏最小二乘法在近红外光谱分析中得到广泛应用，事实上已经成为一种标准的常用方法。下面对这些方法的原理和应用做简单的介绍。2.2.1多元线性回归(MLR)式中y是样品的质量参数，x k是样品的第k个光谱分量(第k个波长处的光谱吸收值)。n是自变量数。从式可以看出在多元线性回归中，只要知道样品中某些成份的浓度，就可以建立样品质量参数体系的定标模型。唯一的要求就是选择好对应于被测质量参数的数据向量(如某些特征波长处的光谱吸收)。多元线性回归的特点是适用于线性关系好的体系，不考虑质量参数之间相互干扰的影响，计算简单，公式含义清楚，对于数据向量(特征波长)

19、较少的体系回归效果较好。多元线性回归的局限性是不能解决光谱矩阵的共线问题，非线性体系回归效果不好，进而影响模型的预测能力。多元线性回归的重要任务就是如何选择参加回归的数据向量，这难免会失去一些有用数据。早期的近红外光谱分析大都采用MLR方法。11-122.2.2主成分回归法(PCR) 主成分回归(PCR)方法是采用多元统计中的主成分分析方法(PCA)，先对混合物光谱量测矩阵X进行分解，然后选取其中的主成分来进行多元线性回归分析，故称之为主成分回归。 主成分回归的核心是主成分分析，而主成分分析方法(PCA)的中心目的是将数据降维，将原变量进行转换，使少数几个新变量是原变量的线性组合，同时，这些变

20、量要尽可能多地表征原变量的数据特征而不丢失信息。经转换得到的新变量是相互正交的，即互不相关，以消除众多信息共存中相互童叠的信息部分。 在主成分回归中，确定参与回归的最佳主成分数尤为重要。如果选取的主因子太少，将会丢失原始光谱较多的有用信息，拟合不充分;如果选取的主因子太多，会将测量噪音过多地包含进来，出现过拟合现象，所建立的模型预测误差会显著增大。因此，合理确定参加建立模型的主成分是充分利用光谱信息和滤除噪音的有效方法之一。有多种选取主因子数的方法，绝大多数采用交叉一验证(Cross一alldation)方法选取。最常用的判断依据是预测残差平方和(PRESS)。主成分回归法应用很广泛，应用于各

21、个领域中。132.2.3偏最小二乘法(PLS)在化学计量学定标方法中，PLS最为常见。设A(n x m)为n个样品在m个波长上的光谱参数矩阵，C(n x L)为n个样品Z种成份含量构成的浓度矩阵。PLS法不直接建立每种成份与光谱参数向量的关系(回归)方程，而是考虑A(n x m)与c(n x L) 的外部关系和联系二者的内部关系，将A(n x m)和C(n x L)分解为如下形式: A(n x m)=T(n x h)P(h x m)+E(n x m) C(n x L)=U( n x h)Q(h x l)+F(n x l) 式中h称为样品的抽象组分数，T(n x h)称为光谱参数特征因子阵，U(

22、n x h)称为浓度特征因子阵，P(h x m)称为光谱参数载荷阵，Q(h x l)称为浓度载荷阵。E(n x m)和F(n x l)分别为光谱参数矩阵的残差矩阵和浓度矩阵的残差矩阵。然后建立T(n x h)与U(n x h)的关系矩阵B(浓度与光谱参数间的内部关系): U(n x h)=T(n x h)B(h x h)此时浓度与光谱参数间的外部关系为: C(n x l)=T(n x h)B(h x h)Q(h x l)+F(n x l)PLS在近红外的运用中又其独到的的优点是:(l)既可以使用全部光谱数据(数据向量多)又可以使用部分光谱数据(数据向量少)。(2)把数据分解和回归融合在一起，得

23、到的特征向量直接与被测成份或性质相关，而不是与数据矩阵中变化最大的变量相关。(3) PLS方法比较适用于处理变量多而样本数少的问题。(4)由于PLS法是一种非线性迭代方法，对于非线性体系和质量参数之间相互干扰的数据回归效果优于MLR方法。 正因为偏最小二乘法的这些优点，在近红外中，它的应用格外广泛，应用于食品、医药、农业等等各个方面。本文也是采用偏最下二乘法来进行定量模型校正的。143.NIR光谱在药物分析中的应用由于NIR光谱分析技术具有分析速度快，对样品无损害，易于实现在线分析等优点，它在药物分析及其相关领域的应用越来越广泛。在制药工业中，NIR光谱技术在辅料和原料药的质量控制，成品的物化

24、性质分析、成品多晶型体的鉴别分析、制剂颗粒度分析、片剂溶出度测定、以及包装材料质量控制和鉴定等方面几乎都有的应用，其优点在于可透过玻璃或高分子包装物直接对药品进行分析。另外，原料药生产过程中NIR光谱技术还被用于化学反应过程或生物发酵过程在线实时检测;在药物生产过程，NIR也已成功用于混合、压片、干燥及包装等生产工艺的在线监测，可及时判断药物组成成分的混合均匀度，干燥和包装的程度，保证产品质量的稳定性。对我国具有特色的中医药，NIR光谱技术主要用于药材辨析、产地鉴别、品质分级、真伪鉴别、定量分析和过程监测，如用于道地药材与非道地药材鉴别，形状相似药材辨析，药材掺假辨析，同一种药不同厂家辨析，药

25、材中主要药效成分分析，药材处理过程中水分、蛋白质、糖类等成分分析。在中药提取分离过程中，在线NIR光谱能实时监测提取液中目标成分的浓度变化，进而判断提取时间以及提取次数等工艺参数。在药物提取液纯化阶段，在线MR光谱能实时监测流出液中目标成分的浓度变化，进而控制流动相和洗脱液的切换时间，以及判断洗脱的终止点，从而优化生产过程，降低生产成本。在线药物分析中常用的高效液相色谱、气相色谱、质谱等分析技术一般采用离线分析方式，存在分析结果滞后的缺点，而NIR光谱技术由于近红外光在光纤中良好的传输特性，可实现在线分析，实时检测生产过程，因而越来越受到药物生产企业的关注。 3.1近红外光谱法用于分析三种对映

26、异构体的组成借助牛血清白蛋白(BSA)与一对对映异构体的特异结合作用，采用近红外光谱法结合偏最小二乘回归(PLS)算法分别对组氨酸、薄荷醇和色氨酸对映异构体混合液中D-异构体的组成含量进行定量分析，并与主成分回归模型和多元线性回归模型进行了比较。对数据预处理方法、建模波段范围和模型参数进行了优化，结果表明近红外光谱结合PLS可成功的用于三种对映异构体中异构体的含量预测;但三种对映异构体的最佳模型的准确度并不相同，其中对组氨酸的预测结果最好，依次为薄荷醇与色氨酸，这可能与BSA与对映异构体的特异结合程度有关。 3.2近红外光谱法同时分析槐米中总黄酮和多糖含量采用近红外光谱法结合支持向量回归(SV

27、R)算法对槐米中总黄酮和多糖的同时测定进行研究，并与PLS模型进行比较。对建模波段和数据预处理方法进行了优化，采用径向基函数为核函数，利用网格寻优算法计算支持向量回归模型的最优参数。结果表明SVR模型对槐米中总黄酮含量预测性能明显好于PLS模型;对多糖含量的预测，SVR模型性能也略好于PLS模型。对两大类物质，两种模型对总黄酮的预测结果都好于对多糖的预测结果。3.3.近红外光谱技术定量分析尼可地尔粉末样品采用近红外光谱法结合SVR算法对尼可地尔粉末样品中尼可地尔含量测定进行研究。利用主成分分析和独立成分分析两种信息压缩算法来改善SVR模型的预测性能，结果表明两种算法对SVR的预测性能均有改进，

28、并且建模速度明显加快;其中独立成分分析对SVR性能改善效果较明显，并使其预测性能优于PLS回归模型。 3.4近红外光谱技术用于板蓝根颗粒厂家鉴别的研究利用聚类分析和支持向量分类(SVC)两种方法结合近红外光谱数据，对三个不同生产厂家的板蓝根颗粒进行分类鉴别。两种方法采用适当的数据预处理和参数设置，在合适的波段范围均能实现板蓝根颗粒的厂家鉴别，但SVC模型的效果更佳，在多个波段范围都可实现100%的分类准确率。较高的分类准确率同时也表明三个厂家的生产工对比，发现后者采集的数据更易于获得满意的分类结果。3.5光谱法研究反式白葬芦醇和虎杖昔与牛血清白蛋白的相互作用主要采用荧光技术分别对反式白葬芦醇及虎杖昔与牛血清白蛋白的相互作用进行了研究，推测了结合机理。利用中红外光谱信息结合二阶导数和自退卷积技术对酸胺I