第12章分子研究技术

1、第12章 分子生物学技术一、名词解释1. 分子克隆 2. 载体 3. 转化 4. 感染 5. 基因工程 6. 转导 7. 转染8. DNA变性 9. DNA复性 10. 退火 11. 筑巢PCR 12. 原位PCR 13. 定量PCR14. 基因打靶 15. DNA芯片 16. 反义核酸技术 17. 核酸探针 二、填空题1DNA重组技术也称为（ ）或分子克隆。最终目的是（ ）。典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上即（ ），形成一个新的重组DNA分子。将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为（ ）

2、。对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。2PCR的反应体系要具有以下条件：a、与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的（ ）。b、具有热稳定性的酶如：（ ）。c、（ ）d、（ ）3PCR的基本反应过程包括：（ ）、（ ）、（ ）三个阶段。4转基因动物的基本过程通常包括：将克隆的外源基因导入到一个受精卵或胚胎干细胞的细胞核中；（）；完成胚胎发育，生长为后代并带有外源基因；（）。5限制性内切酶的切割方式有三种类型分别是（ ）、（）、（）。6质粒DNA具有三种不同的构型分别是：（ ）、（ ）、（）。在电泳中最前面的是（ ）。7外源

3、基因表达系统，主要有（）、（ ）、（ ）和（ ）。8转基因动物常用的方法有：（）、（）、（）。9基因在某一染色体上的排列叫。确定某一基因在染色体上的位置叫做 ，常用的方法有：1、2、3、 。10Southern blotting 用于鉴别_。11在质粒DNA的制备中，用酚或酚-氯仿混合液抽提以除去碱裂解液中残余- -。12质粒的复制类型有两种：受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制的称为（ ），不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制称为（ ）。三、选择题1下列限制性内切酶中，哪一类酶起作用时不需要ATP， A、类B、类C、类D、上述三类答案： B、类2ECOR限制性内切酶的识别和切割的核苷酸序列为 。 A

4、、5-GAATTC -3 B、5-TTTAAA -33-CTTAAG -33-AAATTT -3 C、5-AGCT-3D、5-GGGCCC -33-TCGA -33-CCCGGG -3考查点 ： 限制性内切酶的切割。课本内容： A为E.COR I的切割位点。B为Dra I的切割位点。C为Alu I的切割位点。D为Apa I、ban、Bsp1266的切割位点。答案： A3基因工程生产产品的主要优点为 。A、生产方法简单，成本低廉B、能生产较稀少的药用蛋白，满足人类需要 C、是利用天然微生物生产的，没有毒性 D、A+B+C考查点 ：基因工程的优越性。答案：D、A+B+C四、是非题1用pUC质粒作克

5、隆载体克隆DNA时，人们用显色法筛选重组质粒，即在有IPTG和X-gal的平板上，显示白色的菌落含有原始质粒，而显示蓝色的菌落含有重组质粒。（）2在PCR反应中，对于短的寡核苷酸，退火温度可用下式计算：Tm=2(A+T)+4(G+C) 。（ ）五、简答题1. 基因敲除的基本程序？2. DNA芯片的原理？3. PCR的反应条件？4. 分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？5. 蓝-白筛选的原理？6. SANGER双脱氧链终止法的原理？7. 核酸分子杂交的原理？8. 影响杂交的因素？9. 探针的种类和优缺点？10. 探针的标记法？11. PCR的基本原理？12. PCR引物设计的基本要求？13.

6、 对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？14. 基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。15. 简单说明有那些方法可以得到所需要的基因。16. 基因工程载体种类特点？17. 基因芯片的原理和方法？18对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？19举例说明差示筛选组织特异cDNA的方法？20杂交瘤细胞系的产生与筛选？21. 典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？22. 基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。23. 说明通过胚胎干细胞获得转基因动物的基本过程？24. 什么叫染色体步行法？利用什么原理进行的？简述之。25. 若把一个基因亚克隆到载体上去，可能采取怎样的操作步

7、骤？请简要加以描述。六、论述题1列出5种常用的分子生物学技术并简述各自原理。答案：一、名词解释1. 分子克隆：在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。2. 载体：能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。3. 转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。4. 感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。5. 基因工程：有目的的通过分子克隆技术，人为的操

8、作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。6. 转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。7. 转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。8. DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。9. DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。10. 退火：指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。11. 筑巢PCR：先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物

9、以大片段为摸板扩增获取目的基因。可以提高PCR的效率和特异性。12. 原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。13. 定量PCR：基因表达涉及的转录水平的研究常需要对mRNA进行定量测定，对此采用的PCR技术就叫定量PCR。14. 基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。15. DNA芯片：DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片

10、作为固相支持物，所以称为DNA芯片。16. 反义核酸技术：是通过合成一种短链且与DNA或RNA互补的，以DNA或RNA为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。17. 核酸探针：探针是指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。核酸探针是指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段DNA或RNA分子。18. 基因工程：基因工程就是在基因水平上对生物体进行操作，改变细胞遗传结构从而使细胞具有更强的某种性能或获得全新功能的技术。19. 基因芯片：基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，以基因序列为分析对象的微阵列(mi

11、croarray)，是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。20. 脚印法(footprinting)考查点 ：功能序列的测定。答案：脚印法是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白在DNA上的结合位点的方法。其原理为：将结合有RNA聚合酶的DNA用限制性内切酶切割，得到一个共同的端点，再将端点的一条链同同位素*标记，用微量的DNase I部分水解这个DNA复合物，在不受RNA聚合酶覆盖的区域，每个磷酸二酯键都可能遭受DNase I的攻击。但同一分

12、子上只有少量（1-2个）切点，将所得的片段经碱变性、电泳和放射自显影，就可知道RNA聚合酶在标记链上的覆盖区域的大小，并确定其序列。相关内容：DNA测序的方法及其步骤。21. 聚合酶链反应：利用与DNA模板序列的两端互补的一对 寡聚核苷酸引物来扩增一段DNA序列。由一种热稳定的DNA聚合酶经过三步反应即变性、引物退火和聚合的循环从两个引物来相对延伸。22. DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。23. 考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。24. 蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）

13、该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。25. Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5 3外切酶活性。26. 锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。27. 融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。28. 限制性内切酶：限制性核酸内切酶(restricti

14、on endonuclease)是一类能够识别DNA 的特异序列并在识别位点剪切双链DNA的核酸内切酶.二、填空题1基因克隆，把一个生物体中的遗传信息DNA转入另一个生物体，克隆载体，转化。2 DNA引物，TagDNA聚合酶，dNTP，作为模板的目的DNA序列3变性、退火、延伸。4接种后的受精卵或胚胎干细胞移植到雌性的子宫；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜，培育新的纯合系。5（在对称轴5' 侧切割产生5' 粘端 ）、（在对称轴3' 侧切割产生3' 粘端）、（在对称轴处切割产生平段）。6（ SC构型 ）、（ oc构型 ）、（ L构型 ）。（ SC构型 ）。7（

15、大肠杆菌 ）、（ 酵母）、（ 昆虫 ）和（ 哺乳类细胞表 ）。8（逆转录病毒感染法）、（DNA显微注射法）、（胚胎干细胞法 ）。9遗传图，基因定位，遗传交换定位法，接合定位法，染色体步行和染色体跳跃法。10 DNA。11蛋白质12严紧型质粒，松弛型质粒。三、选择题B A D2考查点 ： 限制性内切酶的切割。课本内容： A为E.COR I的切割位点。B为Dra I的切割位点。C为Alu I的切割位点。D为Apa I、ban、Bsp1266的切割位点。答案：A 3基因工程生产产品的主要优点为 。A、生产方法简单，成本低廉B、能生产较稀少的药用蛋白，满足人类需要 C、是利用天然微生物生产的，没有毒性

16、 D、A+B+C考查点 ：基因工程的优越性。答案：、A+B+C四、是非题×1用pUC质粒作克隆载体克隆DNA时，人们用显色法筛选重组质粒，即在有IPTG和X-gal的平板上，显示白色的菌落含有原始质粒，而显示蓝色的菌落含有重组质粒。（×）考查点 ： pUC系列质粒。课本内容： -互补给pUC系列的载体带来了极大的方便：载体中就没有必要包含3kb以上的-半乳糖苷酶的编码序列。只要包含lac启动子和操作子以及肽编码序列再加上宿主菌的lac ZM15就行了。此外，为保证质粒的稳定性，宿主菌须是lac Iq即lac阻遏蛋白过量表达型。这样，只有在用IPTG诱导时，lac系统才能表达

17、。当pUC系列载体内导入DNA片段时，由于破坏了肽的阅读框或者引入了转录或翻译的终止信号，阻遏了肽的表达。因而在IPTGX-gal平板上不显蓝色。pUC系列载体仍然保留了一个氨苄青霉素抗性基因。答案： 非，-。带有重组质粒的军落不显蓝色。相关内容： -互补的概念。2在PCR反应中，对于短的寡核苷酸，退火温度可用下式计算：Tm=2(A+T)+4(G+C) 。（ ）五、简答题1. 答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。A、打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。B、胚胎干细胞的体

18、外培养C、打靶载体导入胚胎干细胞D、同源重组胚胎干细胞的筛选E、基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡F、胚泡植入假孕小鼠的子宫中G、杂交育种获得纯合的基因敲除动物2. 答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。3. 答：A、PCR反应的缓冲液： l Tris-HCl缓冲液l KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制Taq DNA聚合酶活性。l 加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。l 必要时加入

19、适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。B、镁离子浓度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。 C、底物浓度 工作浓度20-200umol/L， dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。D

20、、Taq DNA聚合酶 75-80时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。E、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80 范围较为理想。F、反应温度和循环次数4. 答：（1）、常用的工具酶A、限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。B、DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。C、DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。D、逆转录酶：依赖于RNA

21、的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。E、末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。F、碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。G、依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。 （2）、良好载体的条件 A、必须有自身的复制子；B、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；C、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；D、载体分子必须有足够的容量；E、可通过特定的方法导入细胞；F、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调

22、控元件。5. 答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。6. 答：DNA链中核苷酸以3,5-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2-脱氧核

23、苷三磷酸。2,3ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。7.答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及

24、离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。8、答：1）核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。 2）温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。 3）离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。 4）杂交液中的

25、甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。 5）核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。 6）非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。9、答：1）、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。2）基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定

26、的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。3）寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。4）RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。 10、答：1）缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase 在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶的53的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延

27、伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。2）随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。3）PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP， 这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。4）末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。11、答：

28、PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA®单链DNA

29、，94。退火：引物单链DNA®杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 左右， Taq DNA聚合酶以4种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物3末端为起点的53DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。12. PCR引物设计的基本要求？答：1）引物长度一般为1530个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74,影响产物的生成。2）引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3端不应有连续3个G和C。

30、否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45 -55。3端和5端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm4(G+C)+ 2(A+T)3）引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6）引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。7）引物与模板结合时，引物的5端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反

31、应的进行。8）引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。13. 对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 14.基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。答：抗生素

32、抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针 过程：多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。如pUC质粒含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以15. 简单说明有那些方法可以得到所需要

33、的基因。考查点 ：目的基因的获取方法。答案：概括地讲，有如下方法可以获得目的基因：PCR法 设计特定的引物，即可以扩增得到特定目的基因。酶法经过特定的限制性内切酶作用及凝胶电泳后可以专一的获取特定大小的目的基因。探针法 用特定的探针（探针根据DNA序列、RNA序列或蛋白质序列进行设计）从总DNA溶液中获取特定目的基因。cDNA法 用特异功能的mRNA进行反转录，也可以获取特定目的基因。用差别杂交或扣除杂交法获取特定目的基因。用mRNA差别显示技术分离目的基因。用表达文库分离目的基因。双酵母杂交体系获取目的基因。如下方法，见姚连生、郑仲承核酸与生命一书（科学出版社，1985-10，8589）密度

34、梯度离心法 适用于有特别密度的目的基因，如1.723g/cm3梯度层分离rDNA。两相分配法目的基因有特殊的碱基组成，而在有机溶剂中相、水相中分配比例不同。逆相层析法用聚氯三氟乙烯粒子作为支持体，将DNA上拄吸附，用梯度盐溶液洗脱：可将珠蛋白基因纯化500倍。多聚赖氨酸法 选择性地沉淀GC含量少的DNA，再用四甲胺处理上清，可沉淀GC含量多的DNA。凝胶电泳法依据目的基因的大小，在酶解DNA片段电泳后，从相应胶区回收其DNA即为目的基因。反转录法 纯化目的蛋白质的mRNA，用反转录法得到其互补DNA。人工合成基因知道蛋白质的氨基酸顺序，就可以根据密码子推断其基因组成并人工合成起DNA序列。16

35、. 基因工程载体种类特点？ 现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。 17. 基因芯片的原理和方法？基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)一致，均应用已知核酸序列

36、作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。具体讲即是将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；然后按碱基配对原理将两者进行杂交；再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。目前，制作基因芯片的公司数以百计，制造工艺也不尽相同，但基本技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、探针标记、杂交反应、信号检测和结果分析。 其中芯片的制备：基因芯片种类较多，主要以玻璃片、硝酸纤维素膜或

37、硅片为载体，制备方法基本上可分为两大类原位合成和合成后交联。原位合成指直接在载体上用四种核苷酸合成所需的探针； 而合成后交联则是将预先制备好的探针利用手工或自动点样装置定位在经特殊处理的载体上。原位合成适用于寡核苷酸；合成后交联多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。18对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。d、改变复制子，变严紧为松

38、弛，变少拷贝为多拷贝。e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 19举例说明差示筛选组织特异cDNA的方法？制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。 例如：在肿瘤发生和发展过程中，肿瘤细胞会呈现与正常细胞表达水平不同的mRNA，因此，可以通过差示杂交筛选出与肿瘤相关的基因。也可利用诱导的方法，筛选出诱导表达的基因。 20杂交瘤细胞系的产生与筛选？脾B细胞+骨髓瘤细胞，加聚乙二醇（PEG）促进细胞融合，HAT培养基中培养（内含次黄嘌呤、氨基蝶呤、T）生长出来的脾B-骨髓瘤融合细胞继续扩大培养。 细胞融合物中包含：脾-

39、脾融合细胞：不能生长，脾细胞不能体外培养。骨-骨融合细胞：不能利用次黄嘌呤，但可通过第二途 径利用叶酸还原酶合成嘌呤。氨基蝶呤对叶酸还原酶有抑制作用，因此不能生长。骨-脾融合细胞：在HAT中能生长，脾细胞可以利用次黄嘌呤，骨细胞提供细胞分裂功能。 21. 典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？a、提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。 b、将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。 c、对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。 d、对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表

40、达。 22. 基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针 多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。 在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。 如pUC质粒含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能

41、表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。 23. 说明通过胚胎干细胞获得转基因动物的基本过程？胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：是胚胎发育期的胚细胞，可以人工培养增殖并具有分化成其它类型细胞的功能。ES细胞的培养：分离胚泡的内层细胞团进行培养。ES在无饲养层中培养时会分化为肌细胞、N细胞等多种功能细胞，在含有成纤维细胞中培养时ES将保持分化功能。 可以对ES进行基因操作，不影响它的分化功能可以定点整合，解决了随机整合的问题。向胚胎干细胞导入外源基因，然后植入到待孕雌鼠子宫，发育成幼鼠，杂交获得纯合鼠。24. 什么叫染色体步行法？利用什么原理进行的？简述之。考查点 ：基因定位的方法及步骤。答案：真核生物的基因较大，在制作基因组文库（一个克隆内的每个细胞内的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，这样的一套克隆叫基因组克隆，其中克隆的一套基因组片段即为基因组文库。）时也常被打断，使之分散在两个或两个以上的克隆中。除了可以不同的探针寻找外，也可以通过已经找到的克隆，取其外源DNA的末端片段进行亚克隆，然后分离这段DNA，经放射性标记，作为探针再与基因组文库中其他克隆进行杂交，以寻找与原来克隆中外缘DNA片段有重叠的基因组克隆。利用这种方法不但可以重建一个大的基因，而且可以鉴定染