第18章 色谱分离原理

1、第18章 色谱法导论 18-1 概述 18-2 色谱基本术语 18-3 色谱法基本理论 18-4 分离度 18-5 定性和定量分析18-1 概述 色谱发展简史 色谱法在工业生产和科学研究中的作用 色谱法的定义与分类一、一、 色谱发展简史色谱发展简史 色谱法的出现 色谱法的发展 色谱法的现状和未来？色谱法的出现 1903年 Tswett （茨维特）研究植物叶子组成时发明了色谱法色谱法的出现 1903年 Tswett （茨维特）研究植物叶子组成时发明了色谱法1906年 Tswett 的研究成果发表 Chromatographie (德语） Chromatography (英语） 色谱 玻璃管=“色

2、谱柱”column 碳酸钙=“固定相”stationary phase 石油醚=“流动相”mobile phase色谱法的发展色谱法的发展 1931年 Kuhn 等用氧化铝和碳酸钙分离了-,-,-胡萝卜素等60多种植物色素 1941年 Martin 和 Synge建立了液液分配色谱法并提出气相色谱的设想 1952年 Martin等发明了气液色谱法 1952年 Martin 和 Synge 获得诺贝尔化学奖A.J.P. MartinR.L.M. Synge气相色谱仪气相色谱仪色谱法的发展色谱法的发展 1957年Goley开创了毛细管气相色谱 1960年代末出现高效液相色谱法 1980年代超临界流

3、体色谱得到发展 1980年代Jorgeson发展了高效毛细管电泳 1990年代后期毛细管电色谱得到重视和发展高效液相色谱仪高效液相色谱仪毛细管电泳仪毛细管电泳仪液相色谱分离速度的变化液相色谱分离速度的变化色谱法的现状和未来色谱法的现状和未来 气相色谱和高效液相色谱发展最好 超临界流体色谱处于失利地位 毛细管电泳与毛细管电色谱处于研究阶段,进入部分应用领域气相色谱和高效液相色谱发展最好气相色谱和高效液相色谱发展最好 气相色谱仪及备件 全球市场: 约10亿美元/年; 3-4%年增长 高效液相色谱仪及备件 6-8%年增长超临界流体色谱处于失利地位 发展晚于GC和HPLC 虽然具有一些独特用途，但大多

4、数功能可由GC和HPLC代替毛细管电泳与毛细管电色谱 为基因组学研究作出了杰出贡献 目前存在的主要问题： 分析结果偏差大 比HPLC大一个数量级 机遇：分离分析生物大分子成功的定量分析方法应具备的基本条件 易于使用，操作费用低 能够得到准确、可重复的定量结果 要能够解决至少一个分析化学中的重要问题 色谱法在工业生产和科学研究中的作用 1930-1940年代为分离复杂的生物组成发挥了独特作用 1950年代为石油工业的发展作出了贡献 1960-1970年代成为石油化工、化学工业等部门的分析检测手段 目前，色谱法已成为生命科学、医药科学、环境科学、材料科学、食品科学、法庭科学以及航天科学等研究领域的

5、重要手段面临的问题 当今化学、生命科学、环境科学等研究领域中备受人们关注的热点问题，如蛋白质组学、代谢组学中的分离分析问题的解决，医学中的药理、药物代谢研究和疾病标记物研究，天然产物有效成分的分离分析，食品安全，毒品、兴奋剂等快速检测等等。复杂体系样品制备检测GC, HPLC, CE, CEC, micro-TASSP(M)E 等分离发展趋势 进一步发展高效分离技术 小型化、微型化、自动化 各种联用技术 样品处理技术 高通量超高效液相色谱（UPLC）chromatogram obtained under isocraticconditions on a 43 cm long capillary

6、 column packed with1.0 m non-porous C18 particles (Eichrom Scientific).超高效液相色谱（UPLC）The sample was run using constant-flow pumps at 52 000 psi on a 38cm long capillary packed with 1.0 m C18 particles.芯片液相色谱ZORBAX 300SBC18 5 m particlesH.-F. Yin et al., presented at the 18th International Symposium o

7、nMicroscale Separations and Analysis, HPCE, San Diego, January 2003.多肽分离图多肽分离图自动化自动化分离分析新技术简介分离分析新技术简介 毛细管电泳 全二维气相色谱 液相色谱气相色谱联用 液相色谱液相色谱联用 色谱质谱联用色谱质谱联用* 样品处理技术毛细管电泳毛细管电泳 毛细管电泳是指溶质以电场为推动力，在毛细管中按淌度差别而实现的高效、快速分离的新型电泳技术。高效毛细管电泳的特点 与传统电泳技术及现代色谱技术相比： 仪器简单、操作方便、易自动化 分离效率高(105 - 107 块/m) 、分析速度快 操作模式多 实验成本低，

8、消耗少 重现较差，分析结果误差大重现较差，分析结果误差大毛细管电泳示意图多维气相色谱全二维气相色谱全二维气相色谱全二维气相色谱液相色谱气相色谱联用液相色谱气相色谱联用液相色谱气相色谱联用液相色谱气相色谱联用橄榄油有机酸液相色谱液相色谱联用液相色谱液相色谱联用液相色谱液相色谱联用模式 同模式 LCLC 多模式 LCLC 全二维 LC(i) 样品的每一部分均经过二维分离。(ii)样品的所有组分等比例经过二维分离。(iii) 第一维具备分离能力。全二维 LC固相微萃取技术Fig.1-2 SPME construction固相微萃取技术Fig.1-5 Desorption chamber for co

9、upling SPME to HPLCFig.1-6 Commercially available interface of SPME-HPLC (Supelco)固相微萃取技术固相微萃取技术固相微萃取技术Monolithic capillary专利申请号：200520095986.1固相微萃取技术三、 色谱法的定义与分类 色谱法是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相（固定相和流动相）间的分配系数的差别分配系数的差别，当两相作相对运动时，各物质随流动相运动，并在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。色谱法的分类 按固定相的使用形式 按流动相的物理状态 按分离机理 按色谱操作方式

10、不同 按流动相和固定相的极性不同 按用途不同分类按固定相的使用形式分类 柱色谱 (column chromatography) 平板色谱 (planar chromatography) 纸色谱 (paper chromatography) 薄层色谱 (thin layer chromatography)按流动相的物理状态分类 气相色谱 气固色谱 气液色谱 液相色谱 液液色谱 液固色谱 超临界流体色谱按分离机理分类 分配色谱 (partition chromatography) 吸附色谱 (adsorption chromatography) 离子交换色谱(ion exchange chroma

11、tography) 排阻色谱 (size exclusion chromatography) 亲和色谱 (affinity chromatography)按色谱操作方式不同分类 迎头色谱 (frontal chromatography) 顶替色谱 (displacement chromatography) 洗脱色谱 (elution chromatography)洗脱色谱（冲洗） 这是色谱过程最常用的方法。将试样加入色谱柱的入口端，然后用流动相冲洗柱子，由于各组分在固定相上的吸附（或溶解）能力不同，于是被流动相带出的时间不同。按流动相和固定相的极性不同 正相色谱 （流动相极性小于固定相） 反相

12、色谱 （流动相极性大于固定相）按用途不同分类 分析型色谱 制备型色谱 流程色谱18-2 色谱基本术语多环芳烃HPLC色谱图一、基线（baseline) 仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值二、峰高h三、保留值 死时间 (tM) 和保留时间 (tR)三、保留值三、保留值 死体积死体积 (VM) 和保留体积和保留体积 (VR) 死体积死体积: 色谱柱中不被固定相占据的空间以及进样系统管道和检测系统的总体积 （VM = tM Fc） 保留体积保留体积: 从注射样品到色谱峰顶出现时，所通过色谱系统的流动相体积（VR = tR Fc）三、保留值 调整保留时间 (tR)和调整保留体积(VR)tR =

13、tR - tM (溶质在固定相中停留的总时间)VR = VR - VM三、保留值 相对保留值 (2,1) relative retention 在一定色谱条件下两个组分的调整保留时间（体积）的比2,1 = tR2/tR1 分离因子 () separation factor = tR2/tR1四、溶质保留方程 保留因子k (retention factor) 容量因子 (capacity factor) （分配比） 在平衡状态下组分在固定相与流动相中的质量之比k = ns / nm 四、溶质保留方程 溶质通过色谱柱的速度或保留值的大小是由每一瞬间该溶质在流动相中的分子分数决定的。 设流动相的平均

14、流速为 u，溶质 x 谱带在色谱柱中的移动速度为 uxux = RuR为溶质 x 在流动相中分子数与总分子数之比四、溶质保留方程 流动相平均流速u和溶质谱带移动速度ux smmnnnRRxMtLutLu四、溶质保留方程 溶质保留方程 MRMMRMmsRMsmmRxtttttktnnttLnnntLuRu1111kt四、溶质保留方程 分离因子 = tR2 / tR1 = k2 / k1 分配系数 K称为相比*KVVKkVnVnCCKMSMmSsms/四、溶质保留方程 根据保留体积与保留时间的关系k = (VR-VM)/VMVR = KVS+VM假如一个溶质的分配比为0.2，则它在色谱柱的流动相中

15、的百分率是多少？ k = ns/nm=0.2 nm= 5nsnm/n100% = nm/(nm+ns)100% = 83.3%习习 题题在某色谱条件下，组分A的保留时间为18min，组分B的保留时间为25.0min，其死时间为2min，试计算：（1）组分B对A的相对保留值；（2）组分A,B的保留因子；（3）组分B通过色谱柱在流动相、固定相保留的时间是多少？各占保留时间分数为多少？ 解：（1）组分B对A的相对保留值 rB/A=tB/tA=(25-2)/(18-2)1.44（2）组分A,B的保留因子 rA=(18-2)/2=8.0 rB=(25-2)/2=11.5（3）组分B通过色谱柱在流动相保留

16、的时间是tM=2min；在固定相保留的时间tB=25-2=23min。各占保留时间分数的8和92。五、区域宽度 标准偏差 半峰宽 Y1/2 基线宽度 Y色谱流出曲线标准偏差半峰宽基线宽度半峰宽度、基线宽度与标准偏差的关系4354. 22/1YY18-3 色谱法基本理论 色谱分离过程 塔板理论 速率理论色谱分离过程改进分离的两种途径塔板理论(Martin &Synge) 色谱柱是由一系列连续的、相等的水平理论塔板组成 在每一块塔板(高度H)中溶质可以在流动相与固定相中迅速达到平衡。H称为理论塔板高度。 流动相进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进入的流动相体积为一个塔板体积。 所有

17、组分开始时存在于第0号塔板上，且试样的纵向扩散可忽略。 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。色谱柱长：色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：则三者的关系为： n = L / H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：塔板理论(Martin &Synge)流出曲线方程 当塔板数 n 50, 色谱流出曲线趋于正态分布 c0 进样浓度，c为时间t时柱出口浓度22202Rttecc色谱流出曲线理论塔板数与理论塔板高度 由塔板理论可以得到理论塔板数 n 与色谱峰半峰宽度或基

18、线宽度的关系 色谱峰越窄，理论塔板数越多，理论塔板高度越小，柱效能越高 n 和 H可作为描述柱效能的指标nLHYtYtnRR222/11654.5有效塔板数和有效塔板高度 同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的，当用塔板数和塔板高度表示柱效能时，必须说明对什么物质而言 有效有效有效nLHYtYtnRR222/11654.5塔板理论的成功与不足 成功点： 流出曲线的形状 浓度极大点的位置 计算和评价柱效能的指标（n, H)塔板理论的成功与不足 不足： 无法回答的问题 1.实验参数如填料的大小、分子结构、温度等对色谱峰形以及塔板数和塔板高度的影响 2.理论塔板高度与流速有关速率理论 (van De

19、emter) 色谱峰展宽的因素 速率理论方程 其它因素（一）色谱峰展宽的因素 涡流扩散 （多流路扩散） 分子扩散 （纵向扩散） 传质阻力 流动相传质阻力 固定相传质阻力涡流扩散涡流扩散 dp 是填料的平均直径 填充不规则因子 L 色谱柱长度Ldp221分子扩散 （纵向扩散）分子扩散 气体分子扩散对色谱峰宽的贡献 弯曲因子 Dg溶质在气相中的扩散系数 u 流动相流速uLDg222传质阻力 物质系统由于浓度不均匀而发生物质迁移过程，称为传质。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。 流动相传质阻力 固定相传质阻力传质阻力流动相传质阻力 k 保留因子kkkfuLDdkfggpg101.0)()(22

20、23固定相传质阻力 df 固定液的液膜厚度 Dl溶质在液膜中的扩散系数2224132)()(kkkfuLDdkfllfl（二）气相色谱速率理论方程 正态分布色谱峰的理论塔板高度可以定义为每单位柱长的方差242322212LH2气相色谱速率理论方程 uCuBAHuDdkfDdkfuDdHgpglflgp2222流速对理论塔板高度的影响（三）液相色谱速率理论方程 气相色谱与液相色谱的区别： 溶质在液相中的扩散系数比在气相中小105倍 液体粘度比气体约大102倍 液体的表面张力比气体约大104倍 液体密度比气体约大103倍 液体不可压缩流动区域中的流动相传质阻力流动区域中的流动相传质阻力uMDpdm

21、CHm2Cm: 与填充性质有关的因子流动相滞留区的传质阻力流动相滞留区的传质阻力uMDpdsmCHsm2Csm: 微孔中流动相及保留因子有关的常数液相色谱速率理论方程uMDpdmCMDpdsmCsDfdsCuMDdCdHp2222液相色谱速率理论方程uCuBAH不同粒径填料色谱柱的H-u曲线液相色谱分离速度的变化（三）其它因素 色谱峰的不对称性 柱外效应吸附等温线KVR = KVS+VM不对称因子(Asymmetry factor)As= A/B As 1 拖尾色谱峰；As 1 前伸色谱峰柱外效应 除了色谱柱中发生的谱带展宽外，柱外区域也会造成谱带的展宽，这种现象称作柱外效应。 主要原因：柱外

22、体积 进样器体积 检测器体积 一些连接管道体积柱外效应216RextcolextcolVVLHHHHH柱外效应 VR 增大时，柱外效应的重要性减低 n 较大时，柱外效应有较大的影响2161RextcolVVnHH柱效和选择性对分离的影响柱效和选择性对分离的影响柱效和选择性对分离的影响色谱分离效果 色谱峰的位置-色谱热力学 色谱峰的宽窄- 色谱动力学18-4 分离度（分辨率） 分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽平均值之比2112)(2YYttRRRs不同分离度时色谱峰的分离程度影响分离度的因素 色谱分离基本方程式 I 柱效因子项； II 分离因子项； III 容量因子项(III)(II)

23、I (11422kknRs色谱分离基本方程式的推导 设两相近的色谱峰基线宽度相等，则有2122112)(2YttRYYttRRRsRRs色谱分离基本方程式的推导2122414116RRRssRRtttnRRtnYYtn方程代入色谱分离基本方程式的推导 由溶质保留方程得 分离因子为： = k2 / k1tR = k tM + tM 色谱分离基本方程式 I 柱效因子项； II 分离因子项； III 保留因子项(III)(II) I (11422kknRsI 柱效因子项 分离度与柱效的关系 Rs n1/2 增加柱长可提高分离度（分析时间增加，柱压降增大） 减小色谱柱的H值，可提高分离度 （有效途径）

24、4nII 分离因子项 分离度与色谱柱选择性的关系 =1，Rs = 0 不能分离 越大， 分离度越大，分离效果越好 Rs确定且已知，可由色谱分离基本方程式计算所需理论塔板数1II 分离因子项222221116 kkRns需要III 保留因子项010203040500.00.20.40.60.81.0k/(k+1)k221kk液相色谱流动相对分离的影响基本分离方程的应用例 有一根1m长的色谱柱，分离组分1和2，得到下列色谱图。图中横坐标l为记录纸走纸距离。若欲得到Rs=1.2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱应加到多长？解 先求分离因子： = tR2/tR1 = (49-5)/(45-5) =

25、1.1 求分离度：Rs = 2(tR2-tR1)/(Y1+Y2) = (49-45)/5 = 0.8 求有效塔板数：n有效=16(tR/Y)2=16(49-5)/5)2=1239 若要使R=1.2,所需有效塔板数为：n有效=16 Rs2 (/(-1)2n有效=16 1.22 （1.1/0.1)2 = 2788 所需柱长为：L=2788/1239=2.25 m18-5 色谱定量分析方法 在一定的操作条件下，分析组分i的质量（mi）或在流动相中的浓度与检测器的信号（峰面积Ai 或峰高 hi）成正比：f 绝对校正因子色谱定量的依据ihiiiAiihfmAfmihiiiAiihfmAfm 准确测量峰面积（峰高） 准确求出比例系数（校正因子） 根据上式正确选定定量计算方法，将测得组分的峰面积（峰高）换算组分含量色谱定量分析方法 峰面积的测量方法 定量校正因子 几种常用的定量计算方法峰面积的测量方法 峰高乘半峰宽法A = 1.065