分子生物学大纲

1、 分子生物学 目录54第一章 绪论2l 第二章 核酸的结构及性质4l 第三章 DNA复制4l 第四章 DNA损伤与修复2l 第五章 可转移的遗传因子2l 第六章 RNA的转录与加工5 l 第七章 蛋白质的生物合成5l 第八章 分子生物学技术8l 第九章 原核基因表达调控4l 第十章 真核基因表达调控4第一章绪论DNA Double Helix model:1953 Watson & Crick基因的基本属性:1.基因的自我复制2.基因控制性状的表达3.基因的突变以DNA, protein为核心 以生物化学为基础Crick： .我本人的思想是基于两个基本原理，我称之为序列假说和中心法则序

2、列假说：核酸片段的特异性完全由其碱基序列所决定，而且这种序列是某一蛋白质的氨基酸序列的密码。中心法则：信息一旦进入蛋白质，它就不可能再输出分子生物学的三大原则1.构成生物大分子的单体是相同的(共同的核酸语言 、共同的蛋白质语言)2.生物遗传信息的表达的中心法则相同3.生物遗传信息的表达的中心法则相同个性 高级结构 生物大分子之间的互作农业是现代生物学研究与应用最为广阔，重要的领域 第二章 核酸与染色体的结构和性质2.1 DNA是遗传物质 2.1.1  转化实验 2.1.1.1 Griffith的发现 2.1.1.2 Avery等人的实验 2.1.2 化学实验2.2 DNA的结构2.2

3、.1  DNA的一级结构 定义：DNA的一级结构指的是DNA分子内碱基的排列顺序。2.2.2  DNA一级结构的方向性       DNA链的方向总是理解为从5'P端 到3'-OH端。       DNA分子总是由脱氧核糖核苷酸组成，核糖的2'位总是H。       RNA分子的核糖的2'位总是OH基。DNA一级结构的多样性 编码蛋白质的遗传信息的多样性 用于调控的序列具有多样性 两种不同遗传信

4、息的比较 相同点：都不是简单地以其一级结构发挥作用，而依赖于与Pro的相互作用。不同点：编码蛋白质氨基酸组成的信息强烈依赖酶系或蛋白质结构来进行基因表达，而调控序列不仅依靠蛋白质作用而且利用自身的双螺旋空间结构的改变来负责基因活性的选择性表达。2.2.3 DNA的二级结构 3.2.3.1 定义：DNA的二级结构指的是由两条DNA链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。 1 每一单链具有 5 3极性2 两条单链间以氢键连接3 两条单链，极性相反，反向平行4 以中心为轴，向 右盘旋 (B-form)5 双螺旋中存在大沟 (2.2nm)，小沟 (1.2nm2.2.3.2 理化特性及维持二级结构稳定的力 主

5、链 碱基对 大沟和小沟 螺距2.2.3.3 DNA二级结构的基本特点 DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。 DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。 两条链上的碱基通过氢键结合，形成碱基对。A总是与T配对，G总是与C配对。2.2.3.4 DNA二级结构的不均一性 DNA上的回文序列（inverted repeats） DNA上的富含AT序列 嘌呤、嘧啶的排列顺序对双螺旋稳定性影响 2.2.3.5 DNA二级结构的多样性 通常情况下，DNA的二级结构分为两大类：一类是右手螺旋的，如BDNA、ADNA、C-DNA等；另一类是局部的左手螺旋，如

6、ZDNA。 天然状态下的DNA大多为B-DNA。 1953年，Watson和Crick首次提出了DNA的反向平行双螺旋模型，该模型所描述的就是BDNA。 其他DNA螺旋结构三螺旋DNA 四螺旋DNA2.2.4 DNA的变性和复性 2.2.4.1 呼吸作用  双链DNA中配对碱基的氢键总是处于不停的断裂和再生状态之中，特别是稳定性较低的富含A-T的区段，氢键的断裂和再生更为明显。在微观上常常表现为瞬间的泡状结构，这种现象称为DNA的呼吸作用。 2.2.4.2 甲醛试验    把标准DNA放到含有甲醛的溶液当中，发现随时间推移，吸光性出现变化（增加），表示D

7、NA由双链变成了单链。这是因为DNA上的NH2在甲醛作用下发生了缩醛反应，使DNA双链不可逆地解开，这个过程又称为甲醛的变性作用。 定义：双螺旋DNA溶解成单链的现象称为DNA变性。 DNA分子变性( DNA denaturation ) D.S. DNA S.S. DNA 加温, 极端pH, 尿素, 酰胺变性过程的表现 DNA粘度降低 DNA 沉降速度加快 DNA分子的A 260 nm UV 值上升核酸在260nm具有强烈的吸收峰，结构越有序，吸收的光越少。游离核苷酸比单链的RNA或DNA吸收更多的光，而单链RNA或DNA的吸收又比双链DNA分子强。 2.2.4.3 增色效应、减色效应和Tm

8、值单链和双链DNA的A260吸收值不同。以50g/mlDNA溶液测量，分别为： 双链DNA   A260=1.00 单链DNA   A260=1.37 双链DNA缓慢加热，其溶液对紫外光的吸收值增加，叫增色效应，而单链DNA缓慢降温，其对紫外光的吸收值减少，叫减色效应。 根据DNA的变性作用，以260nm紫外光吸收值与温度变化作图，可得到一条S形曲线，在相当狭的一个范围内，增色效应出现一个跳跃。通常以紫外吸收值达到最大值的一半时的温度也就是DNA的碱基有50%发生变性时的温度称为融点Tm(melting temperature,Tm) 2.2.4.5复性

9、变性后的DNA用某种方法处理后，使之重新形成天然DNA的过程叫做复性或退火。复性是一个比较慢的过程。      1A     1B     1C     1D' .ATGA.ATGA.CCCC.ATGA. .TACT.TACT.GGGG.TACT.      1A'    1B'    1C' &

10、#160;  1D' 2.2.5 DNA的高级结构超螺旋与拓扑异构现象负超螺旋-拓扑异构酶/溴乙锭->松弛DNA-拓扑异构酶/溴乙锭->正超螺旋  DNA超螺旋结构 超螺旋 超螺旋，简单地说就是螺旋的螺旋，或者我们假定双螺旋存在一个中心轴，这条中心轴再形成螺旋。超螺旋的形成不是一个随机过程，而是在DNA双螺旋存在一种结构张力时才会形成。由于DNA双螺旋的盘绕过度或不足，使DNA分子处于一种张力状态。在封闭环状DNA分子中这种张力不能释放出来，就会形成超螺旋。正、负超螺旋 正超螺旋中心轴的盘绕同双螺旋两条链盘绕的方向相同，也就是同解链方向相反。正超螺旋使螺

11、旋更加紧密，所以把正超螺旋叫过分盘绕DNA。 负超螺旋负超螺旋能让DNA分子通过调整双螺旋本身的结构来减少这种张力，一般是以减少每个碱基对旋转，即放松两股链彼此的盘绕，所以把具有负超螺旋的DNA叫盘绕不足DNA。超螺旋的生物学意义 超螺旋可能有两方面的生物学意义：1超螺旋DNA比松弛型DNA更紧密，使DNA分子体积变得更小，得以包装在细胞内；2超螺旋能影响双螺旋的解链程度，因而影响DNA分子与其他分子，如酶、蛋白质分子的相互作用。 DNA拓扑异构体 具有完全相同顺序，而链环数值不同的DNA，称为拓扑异构体。 在封闭环状DNA 分子中链环数值的改变，即拓扑异构体之间的互变，只有在一条链或两条链有

12、了缺口时才能发生，通常要有酶来催化，此种酶叫拓扑异构酶。 I型异构酶能在一股链上产生一个缺口，而II型异构酶能在两股链上产生缺口。 2.3  染色体2.3.1 染色体概述 染色体的结构要素 1着丝粒（centromere）：细胞分裂时染色体与纺锤丝相连结的部位，为染色体的正常分离所必需。在着丝粒附近有高度重复的卫星DNA（长约510 bp、方向相同的高度重复序列），它们不能与组蛋白结合，形成常染色质区域。 2端粒(telomere)：真核生物线状染色体分子末端的DNA区域 。端粒DNA的特点与功能： 有许多短的正向重复序列。 端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3端突出。 端粒DN

13、A末端不能被外切核酸酶和单链特异性的内切核酸酶识别。 端粒的功能：防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能 原核：简单，没有核膜包围形成真正的细胞核，核酸分子常裸露存在整个细胞中，与少量蛋白质结合，这些蛋白质有些与DNA的折叠有关，另外的参与DNA复制、重组和转录过程。真核：染色体位于细胞核的核仁内， DNA与Pro（组与非组蛋白）完全融合，Pro/DNA的质量比2/1。原核与真核染色体DNA比较 原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因如rRNA基因是以多拷贝形式存在； 整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成； 几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列

14、呈线性对应状态。 2.3.2 真核生物的染色体 真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都以染色质的形式存在。染色质是一种纤维状结构，称为染色质丝。它是由最基本的单位-核小体串联而成的。这里有一系列的结构等级：DNA和组蛋白构成核小体，核小体再绕成一个中空的螺线管成为染色质丝，染色质丝再与许多非组蛋白结合进一步螺旋化形成染色体。 组成：DNA和蛋白质。 特征： 体细胞是二倍体，性细胞是单倍体。 结构相对稳定。 能够自我复制。 能够指导蛋白质的合成。 能够产生可遗传的变异。 2.3.2.1 蛋白质 染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。 组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。

15、真核生物的染色体一般有5种主要的组蛋白，分别命名为：H1、H2A、H2B、H3和H4。 在5种组蛋白中，H1富含赖氨酸，H3、H4富含精氨酸。 鸟类、鱼类和两栖类的红细胞染色体不含H1而代之以H5。 在某些物种的精子中，染色体的结构蛋白是鱼精蛋白。 非组蛋白主要包括与复制和转录有关的酶类、与细胞分裂有关的蛋白等。 2.3.2.2 核小体的装配 核小体：指的是168bp长度的DNA与一组组蛋白构成的致密结构，是构成真核生物染色质的基本单位。 装配过程：两分子的H3和两分子的H4先形成四聚体，然后由H2A和H2B形成的异二聚体在该四聚体的两侧分别结合而形成八聚体。长146bp的DNA按左手螺旋盘绕

16、在八聚体上1.8周，形成核小体的核心颗粒。核心颗粒两端的DNA各有11bp与H1结合，形成完整的核小体。 2.3.3 真核生物的基因组 基因：是指表达一种蛋白质或功能RNA的 遗传物质的基本单位。 基因组  genome原核：就是它的整个染色体。 真核：一个物种单倍体染色体数目。 2.3.3.1 C值矛盾 C值：单倍体基因组中的DNA含量。 不同物种的C值有很大差异： C值矛盾c-value paradox（定义）： 在结构和功能相似的物种中，甚至在亲缘关系相近的物种中，C值差异大。 在不同进化阶元中，某些低等生物的C值比高等生物的C值还大。 2.3.3.2 真核生物基因组不同拷贝的

17、序列组分 单一拷贝的非重复序列  在基因组中只存在一个拷贝。 轻度重复序列  在基因组中只有2-10个拷贝，主要是组蛋白和tRNA等基因。 中度重复序列  这类序列的重复次数在数十到数百次之间。 高度重复序列  有几百到几百万个拷贝。 卫星DNA把基因组DNA切成数千个bp的片段，进行氯化铯密度梯度离心。对一个物种来说，其浮力密度曲线是一条覆盖一定浮力密度范围的一条宽带，但是有些DNA片段却含有异常高或低的G+C含量，常会在主DNA带的附近出现几条次带，其浮力密度曲线出现在主带的前面或后面。G+C含量的变化，使它们与大多数DNA具有不同的浮力密度，浮力密

18、度略重或略轻的DNA即是所谓的卫星DNA。 卫星DNA是一种 高度重复序列。2.3.3.3 真核生物基因组的结构特点 基因组分子量较大。 真核生物DNA常和组蛋白结合形成染色体。 DNA集中在细胞核区，转录在核内，翻译在细胞质中。 真核生物基因组多形成断裂基因。 真核生物DNA序列中有很多重复序列和不编码序列。 真核生物的编码基因常以单拷贝存在，无操纵子形式。 2.3.4 原核生物的基因组 3.3.4.1 原核生物基因组的特点 DNA是裸露的，不形成染色体。 能够最经济地利用DNA序列，除控制区域外，很少有不编码的DNA序列。 原核生物把功能相关的一系列基因高度集中在一起，形成一个操纵子。 基

19、因组中几乎没有重复序列。 原核生物由于没有细胞核，转录和翻译是同步进行的。 2.3.4.2 几种原核生物的基因组 x174 5386bp   11个基因  3个操纵子 5'.GAAGGAGUGAUGUAAUGUCUAAAG.3' x174的mRNA的一段序列 5'.GAAGGAGUGAUGUAA.3'          基因DmRNA的3'端序列 5'.AUGUCUAAA.    基因JmRNA的3

20、'端序列 5'.GAAGGAGUGA.3'       基因EmRNA的3'端序列 E.Coli 4.6*106bp 噬菌体  48502bp 基因与基因概念的发展 基因是生物体遗传信息的基本单位，其本质是DNA（有的生物基因组是RNA），简单的说，基因是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA（RNA）序列。原核生物和真核生物的基因有较大的不同，一个典型的真核基因包括：编码序列外显子；插入外显子之间的非编码序列内合子；5-端和3-端非翻译区(UTR)；调控序列（可位于上述三种

21、序列中）。原核生物与真核生物的基因比较：1.真核生物除配子外，染色体成对，所以同源DNA分子两个；原核生物只有一个DNA（RNA）分子；2.真核生物基因转录为单顺反子；原核生物基因具有操纵子结构，转录为多顺反子；3.真核生物DNA重复顺序较多；原核一般不具重复序列；4.真核生物基因非编码区部分大于编码区部分，无基因重叠现象；原核生物基因编码区部分大于非编码区部分，基因有重叠现象；5.真核生物有内含子（不连续基因或者断裂基因）；原核生物一般无；6.真核生物DNA复制多起点；原核生物DNA复制单起点。基因概念的发展 1移动基因（跳跃基因）2断裂基因3假基因是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本

22、相同，但却不能表达或者表达异常，不能产生有功能的基因产物的失活基因。 4重叠基因2.4 RNA核酸是生物体内重要的高分子化合物，它储存着生物体全部遗传信息。除DNA外，在生物体内还存在着另一种核酸RNA。RNA有许多种类，它们具有不同的生物功能。2.4.1 RNA分子的结构特点RNA通常是单链 RNA分子核苷酸中的糖是核糖而不是脱氧核糖 4种碱基中没有胸腺嘧碇，而有尿嘧啶 2.4.2 RNA的种类 细胞含量最多的几类RNA分子主要的生物功能是参与蛋白质的生物合成。 第一类RNA分子叫做信使RNA（mRNA）它的生物学功能是从DNA上把遗传密码即蛋白质中氨基酸排列顺序的信息接受过来，并起模板作用

23、来合成蛋白质。一般来讲，一种蛋白质就有一种与之相对应的mRNA分子，但有的mRNA分子可以翻译出几条蛋白质分子。mRNA在代谢上是不稳定的。 第二类是转运RNA（tRNA）。生物体内存在着与20种氨基酸对应的tRNA分子。它们在代谢上也是稳定的，在蛋白质的生物合成过程中起接受、转运和掺入氨基酸的作用。 第三类是核糖体RNA（rRNA）。原核生物有三种rRNA（5srRNA16srRNA23srRNA）,真核生物有4种（5s,5.8s,18s和28srRNA）。这些RNA分子在代谢上十分稳定，是生物体内蛋白质合成的“机器”核糖体的重要成分。 上述三类RNA都存在于细胞质中，它们行使生物学功能的主

24、要场所在核糖体上。 在真核生物的线粒体和叶绿体里存在着独立的蛋白质合成系统，也有这几类RNA分子，但是其大小和结构和细胞质中的不完全相同。 此外生物体内还存在着多种具有特定生物功能的RNA分子，例如，参与起动DNA复制的引物RNA，在某些肿瘤病毒中存在着一些类似tRNA的分子是逆转录酶的引物，参与DNA的合成。在某些细菌中有的tRNA分子在细胞壁合成时是甘氨酸的载体。还有一些RNA分子是一些酶活性不可缺少的组成成分，例如兔肌1，4-2-匍聚糖分枝酶含有31个核苷酸的2.8sRNA分子，特异性地作用于tRNA前体的RNAaseP中有77%的成份是核糖核酸酶。真核细胞的核内还存在着许多小分子RNA

25、（snRNA）,其大小从4S到8S不等，大约由80260个核苷酸构成其中有些snRNA在RNA成熟过程式中起重要作用。 另外，还有一些染色质结合的RNA（chRNA）其生物学功能尚不清。 2.4.3 前体RNA绝大多数RNA分子都是在细胞核内合成的。 核内存在着各种RNA的前体，例如tRNA前体、rRNA前体和mRNA。 这些前体RNA的分子量要比对应成熟的RNA的大得多。例如哺乳动物肝细胞的rRNA的前体是45s细胞核RNA（nRNA），在成熟过程中产生41snRNA，32snRNA和20snRNA等中间物，最后相应地成为28s、5.8s和18sRNA。前体RNA都是由细胞核DNA转录产生的

26、，经过剪切、装配和修饰成为成熟的tRNA、rRNA和mRNA，进入细胞质各自行使其生物功能有人把在细胸核内合成后离开细胞核去行使生物功能的RNA分子称作迁移性RNA（Migrating RNA）,而把始终存在于细胞核内的称作非迁移性RNA（Nonmigrating RNA）。 第三章 DNA的复制定义：亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。3.1 DNA复制的基本机理 DNA由两条螺旋的多核苷酸链组成，两条链的碱基通过A:T和G:C之间的氢键联结在一起。在

27、复制过程中首先两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。在此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代的DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(semi conservative replication)。 1958年Meselson和Stahl的实验首次有力地支持了半保留复制方式。他们先将大肠杆菌放在15NH4C1培

28、养基中生长15代，使几乎所有的DNA都被15N标记后，再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。随后，在不同的时间取出样品，用十二烷硫酸钠(SDS)裂解细胞后，将裂解液放在CsC1溶液中进行密度梯度离心(140000g，20小时)。离心结束后，从管底到管口，溶液密度分布从高到低形成密度梯度。DNA分子就停留在与其相当的CsC1密度处，在紫外光下可以看到形成的区带。14N-DNA分子密度较轻(1.7g/cm3)，停留在离管口这较近的位置;15N-DNA密度较大停留在较低的位置上。 当含有15N-DNA的细胞在14NH4C1培养液中培养一代后，只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之

29、间，这时在15N-DNA区已没有吸收带，说明这时的DNA一条链来自15N-DNA，另一条链为新合成的含有14N的新链。培养两代后则在14N-DNA区又出现一条带。在14NH4C1中培养的时间愈久，14N-DNA区带愈强，而14N-15NDNA区带逐渐减弱，但始终未出现其他新的区带。按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N-15NDNA两种分子，而且随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。Meselson和Stahl的实验完全证实了保留复制的设想。  复制起点和复制子DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Origin of replicati

30、on)，用ori表示。DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。 在原核生物中，每个DNA分子上通常只有一个复制子 而在真核生物中，每个DNA分子有许多个复制子，每个复制子长约50-200kb。因此，真核细胞DNA的复制是由许多个复制子共同完成的 既然DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始，而是从特定的区域开始，这说明复制起点有其结构上的特殊性。如科学家们利用分子克隆技术，分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC，发现其含有3个13bp的串联重复保守序列和4个9bp的保守序列DNA复制的特点DNA复制的最主要特点是半保

31、留复制另外，它还是半不连续复制半不连续复制DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条是5'3'方向，另一条是3'5'方向。以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为3'5'，另一条为5'3'。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5'3'延伸，这是一个矛盾。冈崎片段(Okaxaki fragments)的发现使这个矛盾得以解决。 在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以

32、复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3'5'，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿5'3'方向连续进行，这条链称为前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为5''3'，以此为模板的DNA合成也是沿5'3'方向进行，但与复制叉前进的方向相反，而且是分段，不连续合成的，这条链称为滞后链(lagging strand)，合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。 复制的多模式 1单起点、单

33、方向 2多起点、单方向 3单起点、双方向 4多起点、双方向3.2 DNA复制的过程DNA复制过程大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNA复制的终止三个阶段。(一)DNA复制的引发复制的引发(Priming)阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3-OH末端。复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子在有些DNA复制中，(如质粒ColE)，

34、该RNA分子经过加工成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活(transcriptional activation)，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。这种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双

35、链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白（SSB蛋白)结合在被解开的链上。 由复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n'蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。 引发前体进一步与引物酶(primase)or引发酶组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链

36、上沿5'3'方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。 但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。 为什么需要有RNA引物来引发DNA

37、复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。 (二)DNA链的延伸DNA新生链的合成由DNA聚合酶所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题:由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。 但是，在

38、细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种机制可以防止这种现象发生: 1DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和; 2DNA拓扑异构酶要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA拓扑异构酶(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。 这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链，再由DNA聚合酶合成新的DNA链。 前已述及DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶催化，该酶是由7种蛋白质(多肽)组成的聚合体，称为全酶。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。亚基具有聚合功能和5'

39、3'外切酶活性，亚基具有3'5'外切酶活性。另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。 在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶在同一时间分别进行DNA前导链和滞后链复制。如果滞后链模板环绕DNA聚合酶全酶，并通过DNA聚合酶，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。这样，当DNA聚合酶沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶所延伸。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片

40、断便从DNA聚合酶上释放出来。 这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶全酶，并通过DNA聚合酶开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶以同一速度移动。 这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶全酶，并通过DNA聚合酶开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶以同一速度移动。 在DNA合成延伸过程

41、中主要是DNA聚合酶的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶通过其5'3'外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5'3'合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。(三)DNA复制的终止过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。 但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少,在DNA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性DNA分子两端是如何完成其复制

42、的? 已知DNA复制都要有RNA引物参与。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合所填充。但是，在线性分子的两端以5'3'为模板的滞后链的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的在研究T7DNA复制时，这个问题部分地得到了解决。T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。而且，在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'端单链尾巴，两个子代DNA的3'端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DN

43、A聚合酶填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。在研究痘病毒复制时，发现了线性DNA分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。 v 在真核

44、生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。 但最近的实验表明，真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70拷贝的5'TTGGGG3'序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事先已存在的单键DNA末端的TTGGGG序列上。这样有较长的末端单链DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA。这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而

45、逐渐变短。 在环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。3.3 与复制有关的酶和蛋白质3.3.1 DNA复制的复杂性复制过程解链需要能量供应如何维持单链过程DNA复制要求高度真实超螺旋的问题不同生物复制机制不同线性DNA复制过程如何解决最后一个引物是怎样切除的复制体：复制叉上DNA模板以特定的结构与酶和蛋白质偶联成的核蛋白复合物。  3.3.2 原核生物DNA复制的酶学v 3.3.2.1 DNA聚合酶 v 3.3.2.2 引物酶和RNA聚合酶 v 3.3.

46、2.3 解螺旋酶 v 3.3.2.4 单链结合蛋白（SSBP） v 3.3.2.5 依赖于DNA的ATP酶 v 3.3.2.6 DNA连接酶 v 3.3.2.7 旋转酶 3.3.2.1 DNA聚合酶v 以E.coliDNA聚合酶 为例v （1）大肠杆菌DNA聚合酶(DNApolymerase，DNApol)v （2）大肠杆菌DNA聚合酶(DNApol)：（3）大肠杆菌DNA聚合酶(DNApolv DNA聚合酶    主要负责DNA损伤的修复和冈崎片段之间间隙的填补。 v 用枯草杆菌蛋白酶处理DNA聚合酶 可得两个片段，大片段分子量76kd，被叫作klen

47、ow片段，广泛用于DNA序列分析中。 5'3'聚合活性  要求有双链DNA模板和具有3'羟基的引物，活性很高，可达1000核苷酸/min。3'5'外切活性  可以对不配对的局部单链进行识别，切除不配对碱基，又称“校正功能”。 5'3'外切活性  主要功能是切除复制过程中的引物。pol的5'3'外切活性有三个特点： a. 必须有5'-P末端。 b.被切除的核苷酸必须是氢键配对的。 c.可以切除脱氧核糖核苷酸，也可以切除核糖核苷酸。（二）.大肠杆菌DNA聚合酶(DNApol)：(1)聚合作

48、用:该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100个核苷酸。(2)该酶也具有3'5'外切酶活性，但无5'3'外切酶活性。(3)该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。(4)该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。  （三） DNA聚合酶（四）   pol是体内DNA复制的主要承担者，是复制的主要酶类。全酶由多亚基组成.其中、三种亚基组成核心酶

49、，其它为辅助蛋白。 3.3.2.2 引物酶和RNA聚合酶引物酶：用于合成引物的酶。 利福平：抑制RNA的转录，使细菌无法繁殖。用利福平处理发现：先导链不能合成，而后随链能合成。 3.3.2.3 解螺旋酶3.3.2.4 单链结合蛋白（SSBP）SSB没有催化功能，它可以特异性地结合在单链区，使之免被核酸酶水解，起到保护和维持单链的作用。 3.3.2.5 依赖于DNA的ATP酶3.3.2.6 DNA连接酶用于连接3-OH和5-P,形成一个磷酸二酯键。3.3.2.7 旋转酶v 用于消除正超螺旋，恢复负超螺旋结构，需要ATP供能。 3.3.3 真核生物DNA复制的酶学3.3.3.1 真核生物DNA聚合

50、酶v 真核生物中发现有5种DNA聚合酶，分别是：、。 v DNA聚合酶 是DNA复制的主要酶类，由4个亚基组成。原因是： 所有强烈抑制酶的抑制剂都能抑制细胞的复制。 酶的温度敏感突变株使该细胞的DNA复制成呈温度敏感型。 显微注射酶的抗体可以抑制DNA的复制。 酶 的活性随细胞周期而变化，S期活性最高。 DNA聚合酶具有3'5'外切酶活性，对于复制的真实性十分重要。同是也是前导链合成的主要酶类。 目前认为：酶 和酶都是真核DNA复制酶。酶在复制中合成前导链，酶合成后滞链。 3.3.3.2 真核生物DNA解旋酶 3.3.3.3 真核生物端聚酶v 用于复制染色体末端的序列

51、。实际上是一种逆转录酶。 3.4 DNA复制的几种形式3.4.1 线性DNA双链的复制线性DNA先在ori处形成复制泡，从复制眼开始可以单向或双向复制，真核生物都是多复制泡起始的双向复制。 4.2.2 型复制环形DNA大多采用型复制，如E.coli。 特点：从原点ori开始，通常采用双向等速复制，不断扩大复制泡，形成环。3.4.3 滚环型复制某些环形的病毒DNA，如x174、噬菌体都是以这种方式复制。 这是一种单向复制类型。 3.4.4 D-环型（D-loop)动物线粒体DNA的复制方式。单向复制3.5 DNA复制的调控4.5.1 大肠杆菌DNA复制的调控v 原核生物DNA链的延伸速度是恒定的

52、。 v 与生长、增殖相配合协调的DNA的合成，主要依靠复制叉数量的不同。 v 迅速分裂的细胞具有较多的复制叉，分裂缓慢的细胞复制叉较少。 v 细胞复制叉的多少取决于复制起始的频率，这是原核细胞复制的调控点。 v 复制子的调控由复制起始因子和起始位点两部分组成。E.coli的起始位点主要是oriC，与蛋白相互作用来启动复制。主要的起始因子有dnaA、dnaH等蛋白质，它们通过与始位点形成复合物相互作用，确定复制的起始频率。 v 研究发现：dnaA对复制起正调控作用。 4.5.2 真核生物DNA复制的调控v 真核细胞中DNA复制有三个调控点： 细胞生活周期水平的调控 真核细胞的生活周期： G1：复

53、制预备期 S：复制期G2：有丝分裂准备期 M：为有丝分裂期。DNA复制只发生在S期染色体水平的调控复制子水平的调控第四章 DNA的损伤与修复4.1 基因突变基因突变：可以通过复制而遗传的DNA结构的永久性改变。 4.1.1 点突变v DNA分子最常发生的点突变是碱基置换和移码突变两种。 v 一种碱基被另一种碱基所替代称为替换。 v 有两种形式的替换：转换（transition）和颠换(transversion)。 v 转换指的是一种嘌呤替换另一种嘌呤，或一种嘧啶替换另一种嘧啶。 v 颠换指的是嘌呤替换嘧啶或嘧啶替换嘌啶。 v 替换会引起单个密码子发生改变。 表4-1 正常血红蛋白与镰刀形血红蛋

54、白的DNA变化和氨基酸差异链上5、6、7氨基酸的核苷酸密码正常         脯       谷      谷        GGA      CTC      GGA镰刀形         脯&#

55、160;        缬        谷        GGA       CAC      GGA移码突变 v 在DNA的碱基序列中插入一个或几个碱基，或失去一个或几个碱基，使全部密码发生了变化，称为移码突变(frameshift mutaion)。v 移码突变常常导致生物的死亡。 4.1.2 染色体突变涉及到染色体较大区

56、域的突变，主要形式有重复、丢失、倒位和易位等。 4.1.3 基因组突变涉及以基因组为单位的变化，以致影响染色体的数量 4.2   DNA的损伤DNA损伤是在某些因素作用下，DNA的结构和功能发生改变，阻碍DNA的复制与转录，DNA的这种变化称DNA的损伤4.2.1 DNA损伤的原因4.2.1.1 DNA分子的自发性损伤1、DNA复制中的错误 DNA复制中的错配率约在10-10左右，即每复制1010个核苷酸大概会有一个碱基的错误。 2、DNA的自发性化学变化   生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化，至少有以下类型：碱基的异构互变  DNA中的4种碱

57、基各自的异构体间都可以自发地相互变化（例如烯醇式与酮式碱基间的互变）。 这种变化会使碱基的配对性质发生改变，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等，如果这些配对发生在DNA复制时，就会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误性损伤。 碱基的脱氨基作用  碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤（H）、鸟嘌呤会变成黄嘌呤（X）等，遇到复制时，U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。 脱嘌呤与脱嘧啶  自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来。一个哺

58、乳类细胞在37条件下，20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶约500个；估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞（如神经细胞）在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，这占细胞DNA中总嘌呤数约3%。 碱基修饰与链断裂  细胞呼吸的副产物O2-、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次。 4.2.1.2 物理因素引起的DNA损伤v 射线引起的DNA损伤是最引人注意的。 1、紫外线引起的DNA损伤 DNA分子损伤最早就是从研究紫外线的效应开始的。当DNA受到最易被

59、其吸收波长（260nm）的紫外线照射时，同一条DNA链上相邻的嘧啶会以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环（cyclobutane ring）连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体. 人皮肤因受紫外线照射而形成二聚体的频率可达每小时5× 104/细胞，但只局限在皮肤中，因为紫外线不能穿透皮肤。但微生物受紫外线照射后，就会影响其生存。紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。 2、 电离辐射引起的DNA损伤   电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭受损伤，间接效应是指DNA周围的其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生