鼠肝DNA的制备(kit)

1、细胞与分子生物学实验教学平台细胞与分子生物学实验教学平台 鼠肝DNA的制备 Isolation of DNA is often the first step before further analysis（ scientific， Medicine，forensic science） cloning DNA sequencing disease diagnosis genetically modified organisms (GMO) - agriculture, pharmaceutical Environmental testing paternity determinationRele

2、vance of DNA isolationTypes of DNA: genomic （chromosomal） organellar plasmid (extrachromosomal) phage/viral (ds or ss) Plasma membrane and membranes of organelles nuclear envelope included DNA located in nucleus A lot of proteins around High MW and High activity of DNase Add Lysis buffer to cells to

3、 break open cell and nuclear membranes and release nuclear contentsDigest sample with protease to degrade proteinsPrecipitate DNA with isopropanolProtocol： 保持核酸分子完整性和纯度保持核酸分子完整性和纯度, ,措施。措施。 防止外界机械性损伤（动作轻柔、钝口滴管）防止外界机械性损伤（动作轻柔、钝口滴管） 完整性完整性： 防止变性（温度、防止变性（温度、PHPH） 防止降解（防止降解（DNase-DNase-匀浆低温、匀浆低温、EDTAEDT

4、A） 纯度纯度：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子；浓度的金属离子； 其它生物大分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。 分离提纯核酸的最基本要求：分离提纯核酸的最基本要求：Lysis buffer： Tris HCL to maintain the pH of the solution at a level where DNA is stable。 1% SDS to break open the cell and nuclear mem

5、branes, allowing the DNA to be released into the solution (SDS also denatures and unfolds proteins, making them more susceptible to protease cleavage). EDTA to inhibit the activity of DNase。Why？SDSSeparate DNA From Crude Lysate: Phenol:Chloroform：Denatures proteins and solubilizes denatured proteins

6、 Salting Out: At high salt concentration, proteins are dehydrated, lose solubility and precipitate.Usually sodium chloride, potassium acetate or ammonium acetate are used. Precipitated proteins are removed by centrifugation DNA remains in the supernatant.Other reagents: proteinase K：蛋白酶蛋白酶K K，能水解与，能

7、水解与DNADNA结合的核蛋白以及细胞质中会降解结合的核蛋白以及细胞质中会降解DNADNA的的酶。可与酶。可与EDTAEDTA、SDSSDS合用。合用。 RNase ：去除：去除RNARNAPrecipitation of DNA冰乙醇或者室温下的异丙醇冰乙醇或者室温下的异丙醇DNA does not dissolve in alcohol and isopropanolmakes the DNA clump together and precipitate out of solution.Salt-盐，盐，NaclNa+ ions of NaCl bind to the phosphate

8、groups of DNA molecules, neutralizing the electric charge of the DNA molecules.The addition of NaCl making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is added.70% Alcohol：to remove salts and other water soluble impurities but not resuspend the DNA.保存：保存： 温度温度 4最佳和最简单最佳和最简单 -70是长期保

9、存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存保存 保存介质：保存介质： TE缓冲溶液缓冲溶液(最常用最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0Evaluation of genomic DNA UV Spectrophotometry1、 measure of purityPure DNA A260/A280：1.6-1.8Pure RNA A260/A280：1.8-2.0。protein residue： A260/A2801.6organic reagent residue： A260/A2801.3RNA r

10、esidue ： A260/A2802.0 2、Measure of DNA concentrationAt OD260 1OD50ugmL dsDNAOD260nm 50ug/mL= ug/mLChecking the Quality of Genomic by Gel ElectrophoresisIf properly done, genomic extraction should result in bright bands in the very high base pair range of a gel electrophoresis. Sizes of Genomic DNA f

11、or various Species in kbE. Coli 4,640,000bpYeast 12,100,000bpFruit Fly 140,000,000bpHuman3,000,000,000bpPea4,800,000,000bpWheat 17,000,000,000bp其他定量法： 定糖法：定糖法： DNADNA分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰色化合物，该化合物可在色化合物，该化合物可在595-620nm595-620nm波长下进行比色测定。波长下进行比色测定。 定磷法：定磷法： RNARNA

12、和和DNADNA中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%9.5%左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。测定时先将左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。测定时先将核酸用强酸消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，核酸用强酸消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，在经过还原作用而生成蓝色的复合物，最后在在经过还原作用而生成蓝色的复合物，最后在650-660nm650-660nm进行比色测定。进行比色测定。 DNADNA的变性与降解的区别的变性与降解的区别起因起因断裂键断裂键是否可逆是否可逆理化性质理化性质变化变化变性变性加热、极端的加热、极端的pHpH、有机试剂、有机试剂甲醇、乙醇、甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺尿素及甲酰胺氢键氢键是是增色效应增色效应粘度降低粘度降低降解降解酸碱、酸碱、DNaseDNase磷酸二酯磷酸二酯键键否否分子量降分子量降低低鉴别：电泳Protocol:300ul匀浆液3730min+5ul RNase冰浴+蛋白沉淀液 100ul冰浴5min上清转移新EP管+等体积异丙醇12000rpm 10minVotex 25s颠倒30次白色絮状沉淀12000rpm 1min弃上清500ul 70%ETOH干燥数分钟 6530min50u