ELISPOT标准化

1、DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件1酶联免疫斑点及其标准化酶联免疫斑点及其标准化E Enzyme nzyme L Linked inked I ImmunommunoSPOTSPOT达科为生物技术有限公司达科为生物技术有限公司朱义鑫朱义鑫2005.9.16Elispot实验结果（透明板）实验结果（透明板）U-Cytech 公司公司 Elispot实验结果（实验结果（PVDF板）板）U-Cytech 公司公司达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件2v ELISPOTELISPOT技术起源与发展技术起源与发展v 细胞与细胞因子

2、细胞与细胞因子v ELISPOTELISPOT技术原理技术原理v ELISPOT ELISPOT 和和 ELISAELISA的区别的区别v ELISPOTELISPOT的优点的优点第一部分：前言第一部分：前言达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件319831983年年, Czerkinsky&Sedgwick , Czerkinsky&Sedgwick ：计数分泌抗体的：计数分泌抗体的 B B 细胞；细胞；19851985年，年，MoreMore：NCNC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶; ;1

3、9881988年，年，Czerkinsky et.al.: Czerkinsky et.al.: 首次将应用扩展到细胞因子检测领首次将应用扩展到细胞因子检测领域，域，T cell IFN-; ; 同年业发展出双色标记技术；同年业发展出双色标记技术；19931993年，年，Shaw et.al.: Shaw et.al.: 首次将首次将PVDFPVDF膜板引入膜板引入ELISPOTELISPOT19971997年，年，Gui et.al.Gui et.al.：发展出计算机辅助的斑点技术技术。：发展出计算机辅助的斑点技术技术。1.ELISPOT1.ELISPOT技术起源与发展技术起源与发展达科为生

4、物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件4T T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞作用的辅助细胞ThTh。它们参与了细胞免疫。它们参与了细胞免疫(Th1)(Th1)和体液免疫和体液免疫(Th2)(Th2)抗原或者有丝分裂原刺激抗原或者有丝分裂原刺激T T细胞、单核细胞、单核/ /巨噬细胞分泌细胞因巨噬细胞分泌细胞因子子 Th1 cells IFN-,IL-2 Th2 cells IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 Tc cells IFN-,

5、TNF-, 颗粒酶颗粒酶B，穿孔素，穿孔素 单核单核/ /巨噬细胞巨噬细胞 TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12 细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免疫系统调节网络。疫系统调节网络。2.2.细胞与细胞因子细胞与细胞因子达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件5用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。3.ELISPOT3.ELISPOT技术原理技术原理达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课

6、件64.ELISPOT 4.ELISPOT 和和 ELISAELISA的区别的区别ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA ，又突破传统，又突破传统 ELISA ELISA 法，法，是定量是定量 ELISA ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都可检测技术的延伸和新的发展。两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同不同: :n ELISAELISA测定的是测定的是蛋白浓度蛋白浓度，ELISPOTELISPOT测定的是测定的是细胞频率细胞频率；（整体水平与单细胞水平）（整体水平与单细胞水平）n ELI

7、SAELISA是是免疫检测免疫检测ImmunoImmuno-Assay-Assay，而而ELISPOTELISPOT是是生物生物检测检测Bio-AssayBio-Assay（活细胞，功能检测）活细胞，功能检测）n ELISAELISA检测的特异性表现在检测的特异性表现在抗体抗体上，上，ELISPOTELISPOT检测的特检测的特异性及表现在双重的异性及表现在双重的刺激源刺激源和和抗体抗体上。上。达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件75.ELISPOT5.ELISPOT的优点的优点 目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下目前，检测细胞因子或者

8、细胞免疫反应的方法有以下几种：几种：ELISAELISA、ELISPOTELISPOT、FACSFACS、TetramerTetramer、3 3H H胸苷胸苷参入法、参入法、5151CrCr释放法。释放法。 n高灵敏高灵敏：度少至：度少至1001001,0001,000个分子个分子/ /CellCell即能够被检测。比即能够被检测。比ELISAELISA的的灵敏度高灵敏度高200200倍。倍。n单细胞水平单细胞水平：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比FACSFACS灵敏。灵敏。n高通量高通量：每个研究人员每天可作数百样本的检测。：每个研究人员每天可

9、作数百样本的检测。High Throughput High Throughput ScreeningScreening达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件8在在10106 6抗原呈递细胞（抗原呈递细胞（APCAPC）中混入已知数量的）中混入已知数量的IFN-IFN-阳性阳性T T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。X X坐标：各检测方法的检测结果坐标：各检测方法的检测结果 Y Y坐标：每百万坐标：每百万APCAPC中实际中实际IFN-IFN-+ +T T细胞数量细胞数量ELISPOT/FACS/ELISAEL

10、ISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较ELISPOT ELISPOT 流式荧光染色流式荧光染色 ELISAELISA达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件9第二部分：技术特点第二部分：技术特点n技术操作流程技术操作流程nELISPOTELISPOT技术要点技术要点n塑料板与膜板塑料板与膜板n膜结构与抗体包被膜结构与抗体包被n细胞处理细胞处理n有血清与无血清有血清与无血清n刺激物选择刺激物选择n建立阳性对照建立阳性对照n调整适当的细胞浓度调整适当的细胞浓度n预培养法与直接法预培养法与直接法n各种染色系统各种染色系统达科为生物达科为生物DAKEW

11、E BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件10v包被抗体包被抗体 4 4 过夜，洗涤；过夜，洗涤；v封闭封闭37 1h37 1h；v加入淋巴细胞和刺激原加入淋巴细胞和刺激原37 37 孵育孵育8-40h8-40h；v冰水裂解并移出细胞，洗涤；冰水裂解并移出细胞，洗涤；v加入生物素标记的检测抗体加入生物素标记的检测抗体37 1h37 1h，洗涤；，洗涤；v加入酶联亲和素加入酶联亲和素37 1h37 1h，洗涤；洗涤；v加入显色底物，显色加入显色底物，显色1040min1040min；v获得斑点，计数。获得斑点，计数。1，23456781. ELISPOT1. ELISPOT一般操作流程

12、一般操作流程达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件112. ELISPOT2. ELISPOT技术要点技术要点u细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染u细胞在细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关板上孵育时要避免震动，包括开关CO2孵箱孵箱u洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤u洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒的方式倒的方式u洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干达科为生物达

13、科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件12塑料板：塑料板：U-cytechU-cytech公司特有的透明版公司特有的透明版操作简单，方便，省时，价廉，适于初学者以及科学研究。操作简单，方便，省时，价廉，适于初学者以及科学研究。膜板：膜板：PVDFPVDF膜板、膜板、NCNC膜板膜板操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者。操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者。3.3.塑料板与膜板塑料板与膜板达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件13塑料板：塑料板：U-cytech公司特有的透明版公司特有的透明版优点：优点：v透

14、明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞；透明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞；v可以快速包被，节省实验时间；可以快速包被，节省实验时间；v可回收细胞和上清；可回收细胞和上清；v价格只有价格只有PVDFPVDF膜板的一半。膜板的一半。缺点：缺点：v吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解；吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解；v裸视下斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显；裸视下斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显；v只有一种染色系统，不能用于多色分析。只有一种染色系统，不能用于多色分析。修饰的修饰的HRP/银银染系统染系统达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Lt

15、d.整理课件14膜板：膜板：PVDFPVDF膜，膜， NCNC膜膜优点：优点：FPVDFPVDF膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润；膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润；F斑点颜色鲜艳，易于判读；斑点颜色鲜艳，易于判读；F能用于多色能用于多色ELISPOTELISPOT实验。实验。缺点：缺点：F需酒精预湿等步骤，操作稍复杂；需酒精预湿等步骤，操作稍复杂；F因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂；因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂；F几乎不可能回收细胞和上清；几乎不可能回收细胞和上清；F膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。HRP/DABAP/BCIP&NBT

16、HRP/AEC达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件15IFN- IL-5IL-10IFN- PMA/ ionomycin2x105 hu-PBMCindirectLPS/ IFN- 2.5x104 hu-PBMCdirectICE Peptide Pool2x105 hu-PBMCindirectPVDFPVDF板、透明板的典型斑点图像板、透明板的典型斑点图像达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件164. 4. 膜结构和抗体包被膜结构和抗体包被n通常的包被条件是4过夜，也可以室温2小时n37 包被不能超过

17、1小时，否则包被效率急剧降低n膜吸附能力远远超过包被抗体的量，所以需要封闭n包被后必须接着封闭，否则包被抗体会逐渐失活n封闭之后用纯水或PBS洗涤，可以在4长期存储关于膜的一些参数（单孔面积）关于膜的一些参数（单孔面积）厚度：厚度：120-150um最大蛋白吸附量：最大蛋白吸附量： 80-100 ugELISPOT所需量：所需量：1 ug包被抗体集中于膜表面包被抗体集中于膜表面1um(透明板容纳量为：透明板容纳量为：30-40 ug)达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件17 从外周血提取淋巴细胞时从外周血提取淋巴细胞时, , 应避免凝血引起的细胞活

18、应避免凝血引起的细胞活性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过6 6小小时。时。 只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰 从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，加入从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，加入ELISPOTELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液培养孔的细胞须为单细胞悬液 预培养的淋巴细胞若有坏死预培养的淋巴细胞若有坏死/ /凋亡（培养液变黄）会凋亡（培养液变黄）会影响斑点的形成影响斑点的形成 预培养后的细胞入预培养后的

19、细胞入ELISPOTELISPOT培养板前应更换培养液培养板前应更换培养液ELISPOT实验的难点在于细胞处理与培养实验的难点在于细胞处理与培养5. 5. 细胞处理细胞处理 达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件186. 6. 有血清与无血清有血清与无血清u血清是细胞培养所必需的添血清是细胞培养所必需的添加品加品 ，ELISPOT有细胞培养有细胞培养的过程，所以需要血清的过程，所以需要血清u但是血清批次间差异大、成但是血清批次间差异大、成分未可知，为分未可知，为ELISPOT增加增加了严重的不确定性因素。有些了严重的不确定性因素。有些批次的血清严重干

20、扰试验结果。批次的血清严重干扰试验结果。u无血清培养法已经成熟，其无血清培养法已经成熟，其优点：优点：成分固定，彻底消除了批次间的差异，结果可以在全世界的试验室之间比较。不含杂蛋白，背景更弱，斑点更清晰。不含抑制细胞因子分泌成分，斑点更多，更加反映真实的结果。u目前只能用于直接法，间接目前只能用于直接法，间接法孵育时间过长，细胞生长受法孵育时间过长，细胞生长受影响，结果不理想。影响，结果不理想。119 SFC267 SFC我们自己的试验结果：我们自己的试验结果：PHA/10,000 Hu-PBMC上：上：5%小牛血清（杭州）下：无血清培养基小牛血清（杭州）下：无血清培养基U-cytech)达科

21、为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件19n非特异性刺激物非特异性刺激物有丝分裂原有丝分裂原 ConAConA，PMAPMA，PHAPHA，IonomycinIonomycinn特异性刺激物特异性刺激物重组蛋白重组蛋白病毒载体或者病毒颗粒病毒载体或者病毒颗粒重叠肽段重叠肽段表位肽表位肽注意：注意：u直接在直接在ELISPOTELISPOT培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用预培养法。此时可以采用预培养法。u部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物。部分多价抗原刺激物导致细胞

22、凋亡，可以换用单价抗原刺激物。u核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等。刺激物、延长刺激时间等。7. 7. 刺激物选择刺激物选择达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件208.8.建立阳性对照建立阳性对照n非特异性刺激阳性对照：非特异性刺激阳性对照：ConA 伴刀豆蛋白伴刀豆蛋白A 0.4-1.0ug/wellPHA 植物血球凝集素植物血球凝集素 0.3-1.0ug/wellIonomycin 伊诺霉素伊诺霉素 50-100ng/wellPMA 14

23、烷酰佛波乙酯烷酰佛波乙酯 5.0-10ng/welln特异性阳性刺激原：国际标准多肽池特异性阳性刺激原：国际标准多肽池CEF CEF C CMVMV， E EBVBV， ininf fluenza virusluenza virus在在PBMCPBMC的的IFN- ELISPOT IFN- ELISPOT 分析中：分析中：自发斑点频率自发斑点频率：1050/百万PBMC细胞；(十万分之一）PHAPHA刺激频率刺激频率：104105/百万PBMC细胞；（百分之一）CEFCEF刺激频率刺激频率：500 5000 /百万PBMC细胞（千分之一）达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COM

24、PANY Ltd.整理课件21阳性对照实例阳性对照实例未未 刺刺 激激40SFC/百万百万PBMCCEF 刺刺 激激3，400SFC/百万百万PBMCPHA 刺刺 激激26，000SFC/百万百万PBMC人PBMC40万/孔U-cytech无血清培养基人PBMC1万/孔U-cytech无血清培养基人PBMC5万/孔U-cytech无血清培养基4265177达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件229.9.调整适当的细胞浓度调整适当的细胞浓度 1244 692 355 192n20-4020-40万万/ /孔形成最大密度的单层细胞孔形成最大密度的单层细

25、胞n根据所使用刺激原作初步调整根据所使用刺激原作初步调整ConAConA PHA PMA PHA PMA ：0.5-50.5-5万万/ /孔孔特异性刺激物：特异性刺激物：5-405-40万万/ /孔孔n根据预实验的斑点数目作精细调整根据预实验的斑点数目作精细调整人人PBMC/CEF刺激刺激 U-cytech无血清培养基无血清培养基达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件2310. 10. 预培养法与直接法预培养法与直接法p 预培养法即：预先将细胞和刺激物加入预培养法即：预先将细胞和刺激物加入2424孔板中作孔板中作预孵育和刺激，然后再加入预孵育和刺激，

26、然后再加入ELISPOTELISPOT板进行实验。板进行实验。p 大多数大多数ELISPOTELISPOT实验都可以用直接实验都可以用直接ELISPOTELISPOT法得法得到可接受的结果。到可接受的结果。p 预孵育的优点：预孵育的优点：经过预孵育，斑点更分散，清晰经过预孵育，斑点更分散，清晰可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；粒细胞可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；粒细胞的影响（虫啃）也可以大大减轻的影响（虫啃）也可以大大减轻某些细胞因子通常很难用直接法得到结果某些细胞因子通常很难用直接法得到结果，比如颗粒酶、颗粒酶、IL-IL-1010p 预孵育的缺点：预孵育的缺点：

27、需要长时间孵育刺激，更为严格的无菌操作环境需要长时间孵育刺激，更为严格的无菌操作环境需耗费额外的物资和时间需耗费额外的物资和时间达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件24直接法直接法PVDFPVDF刺激物：ICE Peptide Pool40 Hours,2 X 105 Cell/ Well预孵育法预孵育法PVDFPVDF刺激物：ICE Peptide Pool24+16 Hours,2 X 105 Cell/ WellIFN-IFN-直接法与预培养法比较直接法与预培养法比较达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整

28、理课件25直接法直接法PVDFPVDF刺激物：破伤风杆菌40Hours, 2X105Cell/Well预孵育法预孵育法PVDFPVDF刺激物：破伤风杆菌24+16 Hours, 2X105Cell/WellIL-10IL-10直接法与预培养法比较直接法与预培养法比较达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件2611.11.各种染色系统各种染色系统修饰的修饰的HRP/银染系统银染系统HRP/AECAP/BCIP&NBTHRP/DAB透明板：只有一种修饰的透明板：只有一种修饰的HRP/HRP/银染系统，白色不透明斑点。银染系统，白色不透明斑点。PVD

29、FPVDF板：两种标记酶板：两种标记酶 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRP-HRP-显色快，但是背景高显色快，但是背景高(30min)(30min)AECAEC底物，颜色鲜艳，但易退色底物，颜色鲜艳，但易退色DABDAB底物，棕色斑点，着色稍牢固，但是板点松散底物，棕色斑点，着色稍牢固，但是板点松散碱性磷酸酶碱性磷酸酶AP-AP-显色慢，但是背景干净显色慢，但是背景干净(2h)(2h)BCIP&NBTBCIP&NBT混合底物，蓝黑色，着色牢固混合底物，蓝黑色，着色牢固达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件27第三部分：第三部分：ELI

30、SPOTELISPOT标准化标准化 标准化的概念标准化的概念 标准化的实验室管理标准化的实验室管理 标准化的实验操作标准化的实验操作( (SOP)SOP) 标准化的质控参比标准化的质控参比达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件28标准化的概念ELISPOT标准标准化是一套完整的系统：标准化的实验室管理标准化的实验室管理美国建立了Good Laboratory Practices GLP规范标准化的实验操作标准化的实验操作达科为提供ELISPOT标准化的操作程序SOP标准化的质控系统标准化的质控系统质控细胞质控细胞质控阳性刺激物质控阳性刺激物人员培训人

31、员培训质控质控ELISPOT操作操作只有所有的实验室管理都遵循标准化这种规范，所有的实验操作都遵循标准化的这套标准，质控系统才能正常运作，ELISPOT标准化才能真正建立起来。达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件29标准化的操作标准化的操作(SOP)(SOP)n仪器仪器n耗材耗材n试剂试剂n人员人员n操作流程操作流程采血采血分离分离冻存冻存复苏复苏ELISPOTELISPOT程序程序数据分析、处理数据分析、处理达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件30仪器仪器n离心机离心机专业的细胞离心机，指示准确，转速平稳，不晃动，启动制动平稳，最好能控制温度。否则会损失细胞或者伤害细胞。n电动移液器电动移液器有较好的手感，能靠按压的力度的变化灵敏的调节流速。n单道枪和多道枪单道枪和多道枪度量准确，润滑良好，否则会增加污染的机会。达科为生物达科为生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.整理课件31耗材与试剂耗材与试剂n