His标签融合蛋白纯化步骤

1、His标签融合蛋白纯化步骤(Ni-NTA 琼脂糖凝胶亲和层析纯化法)1. 缓冲液配制Lysis Buffer 1 (under native condition)0.5mM Tris.HCl0.5M NaCl5%(w/v) glycerol10mM Imidazol100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteins from E.coli )1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 )0.25% Tween 20 ( or Triton 100 )0.02% NaN 3 (Optional)2

2、 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free ， Recommended)200 g(2 /ml) RNase A (Optional)1mg (10 g/ml) DNasel (Optional)50 mM NaF (Optional)1mM Na 3VO 4 (Optional)+ ddH2O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH此 lysis buffer 适用于从 E.coli 、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带 His 标签的蛋白质。仅在用 于裂解 E.coli 细菌时，加入溶菌酶。Na3VO

3、4 是磷酸酶抑制剂， 保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。 NaF 是酯酶抑制剂， 保护脂蛋白 不被酯酶降解。注意：当使用镍 琼脂糖凝胶纯化带 His 标签的蛋白时，缓冲液中不能加 EDTA ，因 EDTA 能使 镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。Lysis Buffer 2(under denature condition)50 mM Tris-Cl8 M Urea (or 6 M Gu-HCl)10mM Imidazole0.05% Tween 20Adjust pH to 8.0 using NaOHDialysis/Tev cleavage Buffer50 mM Tris-Cl,

4、pH8.0100 mM NaCl (depends on solubility of protein)2.5% glycerol0.5mM EDTA0.5mM DTT or TCEP缓冲液A :50mM Tris.HCI0.5M NaCI5% glycerol0.05% Twee n 20 用高浓度HCI调节pH值至8.0。缓冲液B （洗脱缓冲液）：50mM Tris-Cl0.5M NaCl 5% glycerol0.05% Twee n 20500mM咪唑用高浓度HCI调节pH值至8.0。缓冲液C（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液A和缓冲液B按不同比例配制，配制比例如下（100ml 总体积）：咪唑

5、浓度缓冲液A（ml）缓冲液B（ml）0mM100010 mM98220 mM96450 mM901060 mM8812100 mM8020150 mM7030200 mM6040250mM5050400 mM2080各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45卩m滤膜过滤备用。2.样品预处理：按每克湿重菌体/45ml Lysis Buffer的比例充分悬浮离心收集的菌体，置-80oC冰箱过夜；在4oC融解菌体，vortex悬浮细菌，400w功率下，每个循环超声 5s,冷却5s,每次10 min，共循环2次破碎菌体；4 C、12000rpm离心30min，收集上清液或者用 0.45 m滤膜 过

6、滤，并用低浓度 NaOH调节pH至8.0待纯化。3. 操作步骤介质平衡与亲和取 1ml Ni-NTA 琼脂糖凝胶 （金益肽 TM NTA 货号： JYT-M0007 ），置入 15ml 离 心管中， 2000 rpm 离心 2 min ，移去上清液；加入 5ml Lysis Buffer ，混匀，低速离心， 去上清。加入 4-5 ml 细胞（细菌）裂解液，置于混匀转盘，4oC 低速旋转 1 小时。（每个品牌的 NI 柱载量都不同， 金益肽 TM NI-NTA 琼脂糖凝胶载量 >40mg/ml ，请 根据目标蛋白的浓度、分子量大小、及体积来选取适量的 Ni-NTA 琼脂糖凝胶 ）装柱1）将

7、层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析 柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免 垫片下方滞留气泡。2）打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片 11.5cm 高度时封闭下端出口，用移液管吸取已与样品亲和的介质，将介质加入到层析柱中；在4oC静置10min，让介质自然沉降。3）从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫 片与介质接触面滞留气泡 （如对实验要求并非十分严格， 为提高流速， 可不覆盖上垫片）4）在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、 3）所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。洗柱：用510倍介质体积含10mM咪唑缓冲液C洗去层析柱中未结合蛋白；保留洗涤液，待 SDS-PAGE 电泳检测无目的蛋白后，再