PCR和RTPCR区别Word版

1、传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！pcr和rt-pcr pcr和rt-pcr基础 pcr基础 聚合酶链式反应（pcr）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增dna序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒dna；由rna转化得到的cdna；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是taq dna聚合酶。这种

2、酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和pcr产物的熔点（tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功pcr的影响。 表1. 反应成分 component final concentration template 104-106 copies of dna template primer 1 0.1-0.5µm primer 2 0.1-0.5µm 10x reaction buffer 1x mag

3、nesium 1.0-3.0mm dntp mix 200 mm each dntp thermostable dna polymerase 1-4 units/100 ml reaction rt-pcr基础 rt-pcr将以rna为模板的cdna合成同pcr结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。rt-pcr用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cdna文库克隆cdna。rt-pcr比其他包括northern印迹、rnase保护分析、原位杂交及s1核酸酶分析在内的rna分析技术，更灵敏，更易于操作。 rt-pcr的模板可以为总rna或p

4、oly(a)+选择性rna。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dt)或基因特异性的引物（gsp）起始。rt-pcr可以一步法或两步法的形式进行。在两步法rt-pcr中，每一步都在最佳条件下进行。cdna的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行pcr。在一步法rt-pcr中，逆转录和pcr在同时为逆转录和pcr优化的条件下，在一只管中顺次进行。 传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！图1. rt-pcr概图 这本指南阐述了成功rt-pcr和pcr的关键。高灵敏性（从小量样品中得到足量结果）和高特异性（选择性地仅得到所需的产物）是成功pcr的

5、标志。可以通过仔细的实验设计（如选择恰当的酶，设计最理想的引物，使用不同的缓冲液和添加剂，确定循环参数及制备高质量的模板等）以获得最佳的rt-pcr和pcr。增加rt-pcr灵敏度分离高质量rna 成功的cdna合成来自高质量的rna。高质量的rna至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如edta或sds。rna的质量决定了你能够转录到cdna上的序列信息量的最大值。一般的rna纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的一步法。trizol试剂法（见传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解rna。trizol试剂法可以从最少

6、100个细胞或1mg组织中提取rna。 trizol®试剂步骤略图 一般不必使用oligo(dt)选择性分离poly(a)+rna。不管起始模板是总rna还是poly(a)+ rna，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(a)+ rna会导致样品间mrna丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mrna时，poly(a)+ rna会增加检测的灵敏度。 传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！图2. 总rna和poly(a)+ rna在rt-pcr中的比较 以5或1g hela细胞总rna（分别为泳道1和2）或500ng和50ng he

7、la细胞poly(a)+ rna（分别为泳道3和4）。使用oligo(dt)引物和superscript逆转录酶合成cdna。扩增对象为dna聚合酶mrna 5'端377bp片段和复制酶a mrna的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cdna合成反应产物使用taq dna聚合酶扩增30个循环。 为了防止痕量rnase的污染，从富含rnase的样品（如胰脏）中分离到的rna需要贮存在甲醛中以保存高质量的rna，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的rna，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的rna，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕

8、量rnase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存rna样品的稳定性，可以将rna溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存rna的甲酰胺一定不能含有降解rna的杂物。来源于胰脏的rna至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用rna时，可以使用下列方法沉淀rna：加入nacl至0.2m及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。 在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂以增加cdna合成的长度和产量。rnase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如dtt）存在的条件下加入，因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解rna的rnase。蛋

9、白rnase抑制剂仅防止rnase a，b，c对rna的降解，并不能防止皮肤上的rnase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入rnase。 使用无rnaseh活性（rnaseh-）的逆转录酶 逆转录酶催化rna转化成cdna。不管是m-mlv还是amv，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源rnaseh活性。rnaseh活性同聚合酶活性相互竞争rna模板与dna引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna：dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作为合成cdna的有效底物，降低了cdna合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的rnaseh活性将

10、会大有裨益。superscript逆转录酶，rnaseh- 的mmlv逆转录酶及thermoscript逆转录酶，rnaseh- 的 amv，比mmlv和amv得到更多量和更多全长的cdna（图3）。rt-pcr灵敏度会受cdna合成量的影响。thermoscript比amv的灵敏性强得多（图4）。rt-pcr产物的大小受限于逆转录酶合成cdna的能力，尤其是克隆较大的cdna时。同mmlv相比，superscrip传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！显著提高了长rt-pcr产物的产量（图5）。rnaseh- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42的

11、温度下进行。 图3 逆转录酶对cdna第一链产量的影响 在建议的合成条件下，使用oligo(dt)引物和10ci的-pdctp。第一链的总产量使用tca沉淀法计算。全长cdna使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。   图4 逆转录酶对rt-pcr灵敏度的影响   图5 逆转录酶对长模板rt-pcr灵敏度的影响 以oligo(dt)为引物，使用thermoscript或amv，在50下由hela细胞总rna合成cdna。使用platinum® taq dna聚合酶和人dna聚合酶引物进行35个循环。   人tuberous scher

12、osis mrna（5.3kb）和人dna聚合酶mrna的全长cdna的合成由superscript和mmlv催化。利用oligo(dt)为引物，由5g hela细胞总rna合成cdna。样品使用rnaseh处理，然后使用elongase? enzyme mix将1/10的cdna合成反应产物扩增35个循环。 传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！rnaseh产生的障碍 rnaseh对第一链cdna的影响。rnaseh在cdna合成期间降解rna:dna复合体中的rna。红色箭头代表潜在的酶切位点。 提高逆转录保温温度 较高的保温温度有助于rna二级结构的打开，增加了反应的产量

13、。对于多数rna模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将rna和引物在65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用thermoscript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（gsp）进行cdna合成时（见第三章）。如果使用gsp，确保引物的tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60时使用oligo(dt)和随机引物。随机引物需要在增加到60前在25保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接

14、将rna/引物混合物从65变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cdna热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用pcr仪可以简化rt-pcr所需的多种温度切换。 图6 温度对不同模板的影响 使用thermoscript或amv，以18s rrna基因特异性引物，由10ng大豆总rna在所示温度合成cdna。将1/10的cdna反应产物使用高保真platinum taq dna聚合酶进行40个pcr反应循环。 传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！表2. 逆转录保温温度 reverse transcriptas

15、e incubation temperature amv 37°c-45°c m-mlv 37°c superscriptii rt 37°c-50°c thermoscript rt 42°c-65°c rna在高于65时开始水解，对于1kb的rna第一链合成温度可以为70，对于1kb的rna则需要65。 tth热稳定聚合酶在mg存在条件下 作为dna聚合酶，在mn存在条件下作为rna聚合酶。它可以在最高65条件下保温。然而，pcr过程中mn的存在会降低忠实性，这使得tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cdna的克隆

16、。另外，tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和pcr，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cdna的扩增产物同污染的基因组dna的扩增产物区分开来。 促进逆转录的添加剂 包括甘油和dmso在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开rna二级结构，最多可以加入20的甘油或10的dmso而不影响superscript或mmlv的活性。amv也可以耐受最多20的甘油而不降低活性。为了在superscript逆转录反应中最大限度提高rt-pcr的灵敏度，可以加入10的甘油并在45保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到pcr中，那甘油在扩增反应中

17、的浓度为0.4，这不足以抑制pcr。 rnaseh处理 在pcr之前使用rnaseh处理cdna合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cdna合成反应中的rna会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，rnaseh处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cdna目标模板时，rnaseh处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosis（图7）。对这种困难模板，rnaseh的处理加强了superscript或amv合成的cdna所产生的信号。对于多数rt-pcr反应，rnaseh处理是可选的，因为95保温的pcr变性步骤一般会将rna：dna复合物中的rna水解掉。 图7 rnase

18、h处理对rt-pcr的影响 使用superscript（s）、m-mlv（m）或amv（a），由5g hela rna合成人tuberous sclerosis传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！mrna（5.3kb）的全长cdna，反应产物的一半使用rnash处理30分钟，使用elongase enzyme mix对相当于起始rna 0.5的经处理及未处理逆转录产物进行35个循环的扩增。 小量rna检测方法的提高 当仅有小量rna时，rt-pcr尤其具有挑战性。在rna分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入trizol的同时加入无rnase的糖元

19、。糖元是水溶性的，可以同rna保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无rnase糖元的建议浓度为250g/ml。 在使用superscript的逆转录反应中加入乙酰化bsa可以增加灵敏度（图8），而且对于小量rna，减少superscript的量并加入40单位的rnaseout核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在rna分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用superscript进行逆转录反应时加入bsa或rnase抑制剂。 图9 一步法rt-pcr的灵敏度 使用superscriptone-step rt-pcr system从0，0.1，1，10，10

20、2，103pg hela总rna（分别为泳道1-6）扩增-actin片段。反应在50保温30分钟；942分钟；然后9415秒，5530秒，6890秒进行40个循环；随后在68保温5分钟。反应中包含200 nm正义和反义引物。 一步法同两步法rt-pcr的比较 两步法rt-pcr比较常见，在使用一个样品检测多个mrna时比较有用。然而一步法rt-pcr具有其他优点（表3）。一步法rt-pcr在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cdna合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总rna，这是因为整个cdna样品都被扩增（图9）。对于成功的一步法rt-pcr，一般使用反义的基因特异性引物起始cdna合成。 表3. 一步法和两步法rt-pcr的比较 两步法步骤 一步法步骤 起始第一链cdna合成使用： 起始第一链合成使用 oligo(dt) gsp引物 随机六聚体   gsp引物   优点 优点 灵活 方便