酶的固定化及其应用

1、第四章第四章 酶的固定化酶的固定化酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足l 酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 l 酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 l 产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的

2、困难。 固定化技术固定化技术一、固定化酶的概念一、固定化酶的概念l固定化酶是指固定化酶是指固定固定在一定载体上并在一定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的的空间范围内进行催化反应的酶。酶。 水不溶性载体水不溶性载体水溶性酶水溶性酶固定化技术固定化技术 水不溶性酶水不溶性酶（ 固相酶）固相酶）结合结合酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联交联包埋包埋吸附吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术和固定化酶酶的固定化技术和固定化酶固定化酶与游离酶相比，具有下列优点固定化酶与游离酶相比，具有下列优点： 1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在

3、大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。l 缺点缺点： 1.由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率损失； 2.多了固定化载体成本费用及固定化操作费用，并且固定化酶颗粒的扩散阻力作用会使酶的反应速率下降; 3.比较适用于水溶性的底物和小分子底物。l 固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖

4、核酸酶等结合，制成固定化酶。l 60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从固定化氨基酰化酶从DL-DL-氨基酸连续生产氨基酸连续生产L-L-氨基酸氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。l 在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzymeImmobilized enzyme。二、固定化酶的研究历史二、固定化酶的研究历史l 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体固定化菌体 。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯

5、二酸连续生产酶，由反丁烯二酸连续生产L-L-天门冬氨酸天门冬氨酸。l 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固固定化细胞定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。l 1982年，日本首次研究用固定化原生质体固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。l 活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。

6、l 功能基团功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合。l 酶的高级结构酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。1)1)、固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项三、酶的固定化方法原则和注意事项三、酶的固定化方法原则和注意事项2)2)、制备固定化酶遵循基本原则、制备固定化酶遵循基本原则： l （1 1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。）必须注意维持酶的催化活性及专一性。l （2 2）固

7、定化应该有利于生产自动化、连续化。）固定化应该有利于生产自动化、连续化。（3 3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。l （4 4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于重复使用。回收贮藏，利于重复使用。l （5 5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。废物、产物或反应液发生化学反应。l （6 6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。）固定化酶成本要低，以利

8、于工业使用。 l 酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大体可概括结合的化学反应的类型进行分类，大体可概括为四种类型：为四种类型：l 1.1.吸附法；吸附法； 2.2.结合法；结合法； 3.3.交联法交联法; 4.; 4.包埋法包埋法 四、酶的固定化方法四、酶的固定化方法 利用各种固体利用各种固体吸附剂将酶或含酶吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面菌体吸附在其表面上，而使酶固定化上，而使酶固定化的方法称为物理吸的方法称为物理吸附法。附法。1.1.吸附法

9、吸附法l吸附法吸附法l常用的固体吸附剂常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、：活性炭、氧化铝、硅藻土、羟基磷灰石等。硅藻土、羟基磷灰石等。l优点优点：操作简便，条件温和，不引起：操作简便，条件温和，不引起酶失活，载体廉价，酶失活，载体廉价，而且可反复使用。而且可反复使用。l缺点缺点：结合力弱，易解吸附结合力弱，易解吸附由于靠物由于靠物理吸附作用，理吸附作用，结合力较弱结合力较弱，酶与载体，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。到一定的限制。吸附法吸附法（1 1）常用载体）常用载体无机物无机物有机物有机物高分子化合物高分子化合物活性炭、白陶土、活性炭、

10、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶硅胶、碳酸钙凝胶淀粉麸质、大孔树脂、淀粉麸质、大孔树脂、DEAEDEAE纤维素、纤维素、DEAEDEAE葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（2 2）固定化酶的制备机理）固定化酶的制备机理所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。（3 3）优缺点）优缺点 优点优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的 高级结构高级结构; ;方法简单，成本低。方法简单，成本低。 缺点缺点：酶吸附不牢固，易脱落；：酶吸附不牢固，易脱落； 防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应防止吸附酶的蛋白质与载

11、体发生变性反应吸附法固定化酶举例吸附法固定化酶举例载体载体固定化酶固定化酶活性炭活性炭 淀粉酶、淀粉酶、 淀粉酶淀粉酶蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶多孔玻璃多孔玻璃核糖核酸酶、木瓜蛋白酶核糖核酸酶、木瓜蛋白酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶氧化铝氧化铝葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶碳酸钙凝胶碳酸钙凝胶亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶纤维素纤维素胰蛋白酶、核糖核酸酶胰蛋白酶、核糖核酸酶麸素麸素淀粉液化酶淀粉液化酶硅胶硅胶磷酸化酶磷酸化酶2.2.结合法结合法l 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。

12、起的固定化方法称为结合法。l 根据酶与载体结合的化学键不同，根据酶与载体结合的化学键不同，可分为可分为共价结合法共价结合法和和离离子结合法。子结合法。离子键结合法离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-DEAE-纤维素纤维素、TEAE-TEAE-纤维纤维素素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶等。等。 共价键结合法共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法通过共价键将酶

13、与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素纤维素、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶、甲壳质甲壳质、氨基酸共聚氨基酸共聚物物、甲基丙稀醇共聚物甲基丙稀醇共聚物等。等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使必须首先使载体活化载体活化。共价键结合法共价键结合法 酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备

14、固定化酶的方法。即，通过固定化酶的方法。即，通过化学共价键化学共价键，把与，把与酶酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水连接在不溶于水的的载体载体上上。（1 1）酶与载体反应的主要功能基团）酶与载体反应的主要功能基团游离羟基：肽链游离羟基：肽链C C末端的末端的 羧基，天门冬酰氨酸羧基，天门冬酰氨酸 ，谷氨酸的，谷氨酸的羧基羧基 游离氨基：肽链游离氨基：肽链N N末端的末端的 氨基，氨基， 赖氨酸赖氨酸 氨基氨基巯基：半胱氨酸巯基：半胱氨酸羟基：丝氨酸，苏氨酸羟基：丝氨酸，苏氨酸酚基：酪氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：组氨酸咪唑基：组氨酸共价键结合法共价键结合法（2

15、2）所用载体）所用载体重氮化法重氮化法：具有氨基的不溶性载体（：具有氨基的不溶性载体（R RNHNH2 2）。）。 以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。 多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃烷烷 化化 法法：卤族的乙酰衍生物卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤 维素、碘乙酰纤维素）维素、碘乙酰纤维素） 含卤族的高聚物含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）共价键结合法共价键结合法（3 3）固定化酶的制备机理）固定化酶的制备机理将与载体反应的将与载体反应的功能基团

16、与各种功能基团与各种重氮化剂重氮化剂、烷化烷化剂剂等反应形成等反应形成共共价键价键制备固定化制备固定化酶。酶。纤维素纤维素+ +盐酸甲醇盐酸甲醇CMCCMC甲酯甲酯肼肼CMCCMC酰肼酰肼CMCCMC叠氮化物叠氮化物NHNH2 2酶酶亚硫酸钠亚硫酸钠盐酸盐酸固定化酶固定化酶 CHCH2 2CO-NHCO-NH酶酶CMCCMCCHCH2 2COOHCOOH制备酰肼制备酰肼叠氮化物叠氮化物羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序共价键结合法共价键结合法（4 4）优缺点）优缺点优点优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长：酶与载体结合较牢固，不易脱

17、落，有利于长 时间使用。时间使用。缺点：缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏离子键结合法离子键结合法酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶（1 1）所用载体）所用载体纤维素的衍生物，离子交换树脂纤维素的衍生物，离子交换树脂（2 2）固定化酶的制备机理）固定化酶的制备机理酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子交换剂上。离子交换剂上。（3 3）优缺点）优缺点优点优点：操作

18、简便，处理条件温和，酶的高级结构：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构 和活性中心不易破坏，有利于制备高活性和活性中心不易破坏，有利于制备高活性 酶酶缺点缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下 酶易从载体上脱落酶易从载体上脱落第一个离子结合法固定化酶：第一个离子结合法固定化酶：DEAE-CelluloseDEAE-Cellulose固定化过氧化氢酶固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：第一个工业化的固定化酶：DEAE-SephadexDEAE-Sephadex A-50 A-50固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶3.3.交联法交联法l借助双功能试剂使酶

19、分子间发生交联借助双功能试剂使酶分子间发生交联作用作用, ,制成网状结构的固定化酶的方法制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。称为交联法。l常用的双功能试剂有：戊二醛、己二常用的双功能试剂有：戊二醛、己二胺等胺等、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（白质的游离氨基反应，形成席夫（SchiffSchiff）碱，）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。化菌体。交联法

20、制备的固定化酶或固定化菌体交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较酶活力损失较大大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗颗粒较小粒较小，给使用带来不便。为此，给使用带来不便。为此，可将交联法可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。 先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂 戊二醛戊二醛与与酶蛋白的氨基酶蛋白的

21、氨基之间之间交联交联起来，形成起来，形成酶网酶网包围在包围在 载体表面。载体表面。 常用载体常用载体：硅胶、离子交换树脂。：硅胶、离子交换树脂。交联法酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶l优点优点: :结合牢固结合牢固, ,可以长时间使可以长时间使用用. .l缺点缺点: :反应条件剧烈，酶活力损反应条件剧烈，酶活力损失大，制备成的固定化酶颗粒失大，制备成的固定化酶颗粒较小，使用不方便。较小，使用不方便。4.4.包埋法包埋法l 将酶或含酶菌体包埋在各种多

22、孔载体中，使酶将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。固定化的方法。l 载体：琼脂、海藻酸钠、明胶聚丙烯酰胺等载体：琼脂、海藻酸钠、明胶聚丙烯酰胺等l 包埋法可分为包埋法可分为凝胶包埋法凝胶包埋法和和微胶囊法微胶囊法。凝胶包埋法凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶

23、、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 微胶囊法微胶囊法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。胺膜、火棉胶膜等。 包埋法包埋法酶液酶液丙烯酰丙烯酰胺胺N N，N N双丙烯双丙烯酰胺酰胺氢气氢气催化剂：四催化剂：四甲基乙二胺甲基乙二胺、明矾胺、明矾胺引聚剂：引聚剂：过硫酸钾、核黄素过硫酸钾、核黄素光照光照聚合反应聚合反应凝胶酶块凝胶酶块固定化固定化酶酶切切割割凝胶包埋法

24、凝胶包埋法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）凝胶或膜凝胶或膜酶酶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶、淀粉酶淀粉酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 淀粉淀粉胆碱酯酶胆碱酯酶琼脂琼脂青霉素酰胺酶青霉素酰胺酶制备的固定化酶制备的固定化酶微型胶囊法微型胶囊法（1 1）原理）原理 把把酶包在酶包在超薄半透性超薄半透性的的聚合物膜聚合物膜中，制成中，制成球状含酶球状含酶微型胶囊微型胶囊。特点特点微囊直径几微米几百微米。微囊直径几微米几百微米。低分子底物低分子底物可以自由通过可以自由通过并并进入微囊进入微囊内。内。与酶反应后的与酶反应后的生成物被排除在微囊外生成物被排除在

25、微囊外，酶本身酶本身是高分子物质不能通过微囊而是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内表表面面聚聚合合法法以以亲水性单体亲水性单体和和疏水性单体疏水性单体在表面发生聚合反应将在表面发生聚合反应将酶包围起来，形成微型胶囊酶。酶包围起来，形成微型胶囊酶。分分三三步：步：常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类亲水性单体亲水性单体疏水性单体疏水性单体生成的聚合物生成的聚合物聚胺聚胺聚异氰衍生物聚异氰衍生物聚胺、聚酯聚胺、聚酯乙二醇、多元醇乙二醇、多元醇聚异氰

26、衍生物聚异氰衍生物聚胺、聚酯聚胺、聚酯（3）方法方法 表面聚合法表面聚合法、液中干燥法、相分离法、液中干燥法、相分离法A A 乳化分散乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。溶于水的有机溶媒中充分乳化。B B 表面聚合表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。来形成微型胶囊球。三步三步：C C 清洗清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单

27、体。余单体。1 1微型胶囊法形成的固定化酶微型胶囊法形成的固定化酶胶囊制法胶囊制法囊膜的素材囊膜的素材应用的酶应用的酶表面聚合法表面聚合法尼龙尼龙乳糖酶乳糖酶羧基脱氢酶羧基脱氢酶聚合脲聚合脲天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶液中干燥法液中干燥法聚苯乙烯聚苯乙烯过氧化氢酶过氧化氢酶脂肪酶脂肪酶脲酶脲酶相分离法相分离法火棉胶火棉胶过氧化氢酶过氧化氢酶天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶硝酸纤维素硝酸纤维素天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶缺点缺点： 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防 治酶的失活和变性。治酶的失活和变性。优点优点： A A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。制备条件温和，

28、制得的胶囊不易变化。 B B 能很好地保存天然酶的活性和特性。能很好地保存天然酶的活性和特性。 C C 大小可任意调节，制备时间短。大小可任意调节，制备时间短。微型胶囊法优缺点微型胶囊法优缺点首先被采用包埋法的是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发剂举例：制备珠状聚丙烯酰胺包埋举例：制备珠状聚丙烯酰胺包埋-半乳糖半乳糖苷酶苷酶l乳糖酶（乳糖酶（100g100g）溶解在磷酸缓冲液中，取）溶解在磷酸缓冲液中，取1mL1mL酶缓冲液，加入丙烯酰胺单体和酶缓冲液，加入丙烯酰胺单体和N-NN-N- -甲叉双丙烯酰胺的溶液中，再加入二甲氨甲叉双丙烯酰胺

29、的溶液中，再加入二甲氨基丙腈，过硫酸钾作引发剂，混合基丙腈，过硫酸钾作引发剂，混合1010分钟，分钟，得到含酶的凝胶孔径。得到含酶的凝胶孔径。海藻酸钙海藻酸钙包埋法装置包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控颗粒大小可实时监控脂质体包裹脂质体包裹l优点优点：反应条件温和，很少改变酶：反应条件温和，很少改变酶结构，包埋在高聚物内的方法对大结构，包埋在高聚物内的方法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞

30、都适用。物细胞都适用。l缺点缺点：往往会引起部分酶的变性失：往往会引起部分酶的变性失活，包埋条件要严格控制。活，包埋条件要严格控制。方 法优 点缺 点物理吸附法制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小共价结合法载体与偶联方法可选择性大；酶的结合力强，非常稳定偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶联试剂有一定毒性交联法 可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高交联条件激烈，机械性能差包埋法 包埋材料、包埋方法可选余地大，固定化酶的使用面广，包埋条件温和仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问

31、题各种酶固定化方法的比较各种酶固定化方法的比较五、固定化酶的性质五、固定化酶的性质 由于固定化可能对由于固定化可能对酶本身酶本身和和酶所处的环境酶所处的环境产生一定的影响，产生一定的影响，因此固定化酶和游离酶表因此固定化酶和游离酶表现有所不同，掌握这些性质对有效地应现有所不同，掌握这些性质对有效地应用固定化酶和研究酶的生物学作用都很用固定化酶和研究酶的生物学作用都很重要。重要。酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。1 1 对底物的特异性对底物的特异性。尤其注意立体结构对催化底物特异。尤其注意立体结构对催化底物特异性的影响。性的影响。2 2 酶反应最

32、适酶反应最适PHPH值的改变值的改变。酶固定化后，酶蛋白质的电。酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规律，可调整固定化方法，获得最适合的反应条件。律，可调整固定化方法，获得最适合的反应条件。3 3 动力学常数的改变动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变。米氏常数和最大反应速度会改变4 4 酶反应温度的改变酶反应温度的改变5 5 增加酶的稳定性增加酶的稳定性。对热、。对热、PHPH值、有机溶媒、蛋白质变值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。连续化反应稳定性连续

33、化反应稳定性好。好。固定化酶的最大好处固定化酶的最大好处作用于低分子底物的酶：特异性没有明显变作用于低分子底物的酶：特异性没有明显变化化作用于大分子低物的酶：特异性往往会变化。作用于大分子低物的酶：特异性往往会变化。1.1.底物特异性变化底物特异性变化2.pH2.pH的变化的变化lPHPH对酶活性的影响：对酶活性的影响：l（1 1）改变酶的空间构象）改变酶的空间构象l（2 2）影响酶的催化基团的解离）影响酶的催化基团的解离l（3 3）影响酶的结合基团的解离）影响酶的结合基团的解离l（4 4）改变底物的解离状态，酶与底物）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。不能结合或结合后

34、不能生成产物。pHpH对固定化酶的影响对固定化酶的影响l 1 1）载体带负电荷，）载体带负电荷，pHpH向碱性方向移动。向碱性方向移动。 l 微环境微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为液称为宏观环境。宏观环境。固定化酶的最适固定化酶的最适pHpH值由载体性质和产物性质决定值由载体性质和产物性质决定l载体带正电荷，载体带正电荷，pHpH向酸性方向移动。向酸性方向移动。2 2）产物性质对体系）产物性质对体系pHpH的影响的影响l 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pHpH值比游离值比游离酶的酶的pHpH值高；

35、反之则低值高；反之则低3 3米氏常数米氏常数KmKm的变化，的变化，KmKm值随载体性值随载体性质变化质变化l （1）载体与底物带相同电荷，KmKm固定化酶降低了酶的亲和力。l （2）载体与底物电荷相反，静电作用，KmKm一般与游离酶差不一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。多，但有些会有较明显的变化。l(1)(1)操作稳定性提高操作稳定性提高l(2)(2)贮存稳定性比游离酶大多数提高。贮存稳定性比游离酶大多数提高。l(3)(3)对热稳定性，大多数升高，有些反对热稳定性，大多数升高，有些反 而降低。而降低。l(4)(4)对分解酶的稳定性提高。对分解酶的稳定性提高。l(5)(5)对变性剂的

36、耐受力升高对变性剂的耐受力升高5.5.固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响固定化后酶稳定性提高的原因固定化后酶稳定性提高的原因 大多数酶在固定化以后，一般都有较高的稳定性大多数酶在固定化以后，一般都有较高的稳定性和较长的有效寿命，其和较长的有效寿命，其原因原因可能是：可能是：l a.a.固定化后酶分子与载体多点连接固定化后酶分子与载体多点连接, ,增加了酶构型增加了酶构型的牢固程度；的牢固程度；l b.b.阻挡了不利因素对酶的侵袭；阻挡了不利因素对酶的侵袭；l c.c.酶活力的释放是缓慢的酶活力的释放是缓慢的; ;l d.d.限制了酶分子间的相互作用限制了酶分子间的相互作用, ,抑制自

37、降解，提高抑制自降解，提高了酶稳定性。了酶稳定性。 但是如果固定化触及到酶活性敏感区，也可能导但是如果固定化触及到酶活性敏感区，也可能导致稳定性下降。致稳定性下降。六六 需注意的几个方面问题需注意的几个方面问题（一（一）酶活性的测定方法酶活性的测定方法（二）（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法制备过程中保持酶活性稳定的方法（三）（三）固定化酶的保存方法固定化酶的保存方法（一）酶活性的测定方法（一）酶活性的测定方法1 1 测定酶的固定化量测定酶的固定化量 固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液）固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液） 中残存的酶含量。中残存的酶含量。2 2 测定

38、颗粒直径测定颗粒直径 固定化酶的粒径越小，酶活性越高。固定化酶的粒径越小，酶活性越高。固定化酶颗粒直径固定化酶颗粒直径 大小影响酶活性。大小影响酶活性。3 3 测定酶反应最适测定酶反应最适pHpH值值 酶固定化后反应的最适酶固定化后反应的最适pHpH较原来的酶有所变化。较原来的酶有所变化。4 4 检查酶是否脱落检查酶是否脱落 测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经 过适当保温检查是否还继续进行反应，过适当保温检查是否还继续进行反应，如果溶液中出现酶如果溶液中出现酶 反应，说明酶脱落。反应，说明酶脱落。 （二）制备过程中保持酶活性稳定的方

39、法（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法1 1 包埋法、聚丙烯酰胺凝胶法或微型胶囊法时，固定化包埋法、聚丙烯酰胺凝胶法或微型胶囊法时，固定化 反应时，反应时，预先用与酶有特异亲和力的底物等，保护酶预先用与酶有特异亲和力的底物等，保护酶 的活性中心的活性中心，而后再进行固定化反应。，而后再进行固定化反应。2 2 以酶的前体状态进行固定化以酶的前体状态进行固定化，然后经过活化制备固定，然后经过活化制备固定 化酶。化酶。3 3 防止酶在催化反应中活性下降防止酶在催化反应中活性下降下降原因下降原因 （1 1）酶的变性）酶的变性 （2 2）吸附了酶的抑制物质。）吸附了酶的抑制物质。 （3 3）被微生物污染

40、）被微生物污染 （4 4）酶脱落）酶脱落 （5 5）载体崩溃或变形分解）载体崩溃或变形分解 （6 6）操作失误）操作失误（三）固定化酶的保存方法（三）固定化酶的保存方法使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。 1 1 真空冷冻干燥保存（长期保存）真空冷冻干燥保存（长期保存） 2 2 低温保存低温保存 3 3 多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体 更适于长期保存。更适于长期保存。 4 4 无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具 有较好的保存性。有较好的保存性。 七

41、七. .固定化对酶活性及酶反应系统的影响固定化对酶活性及酶反应系统的影响 固定化对酶活性及酶反应系统所产生的影响十分复杂，常因酶的种类、反应系统的组成、特别是固定化方法以及固定载体而显著不同。在大多数情况下，固定化酶的活力低于相同的游离酶，但也有些固定化不引起酶活力下降，有时反应速度甚至还可能升高。固定化对酶活性及酶反应系统的影响因素固定化对酶活性及酶反应系统的影响因素： 1 构象改变、立体屏蔽以及微扰 2 分配效应和扩散限制 1) 1) 构象改变、立体屏蔽以及微扰构象改变、立体屏蔽以及微扰 这些效应能直接影响酶的催化活性，它们的产生或者和固定化过程有关，或者和载体的性质有关，或者二者兼有之。

42、 构象改变构象改变 是指固定化过程中酶和载体的相互作用引起了酶的活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性下降的一种效应。 该效应比较难于定量描写，也比较难于预测，但通常多出现于吸附法和共价偶联法。 立体屏蔽立体屏蔽 是由于载体的孔隙太小，或是由于固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。 这种效应也难于定量描写，多见于包埋，吸附法或共价偶联法。 微扰微扰 是由于载体的亲水、疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应能力的一种效应。 这种效应更难于定量描写和预见，但是通过改变载体与介质

43、的性质可作出判断与调节。 2).2).分配效应和扩散限制分配效应和扩散限制 这两种效应和微环境密切相关。所谓微环境，即是和固定化酶紧邻的微观局部环境，它和宏观体系不同，是引入了固定化载体以后产生的新概念。 分配效应分配效应 是由于固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其它效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。扩散限制效应扩散限制效应 是指底物、产物以及其它效应物的迁移 和运转速度受到限制的一种效应。乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶八

44、、固定化酶的应用八、固定化酶的应用世界上第一种工业化生产的固定化酶。世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。 泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala高果糖浆l也称果葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖也称果

45、葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。糖浆。 高果糖浆的生产高果糖浆的生产淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液喷雾干燥氢化还原结晶异构酶粉状葡萄糖山梨醇结晶葡萄糖果葡糖浆果糖42%葡萄糖55%低聚糖分离混合高果糖浆果糖浆果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，

46、制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。 固定化酶法生产高果糖浆青霉素酰化酶转化流程图青霉素酰化酶转化流程图酶电极酶电极l 酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。l 酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。l 较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极葡萄糖酶电极。葡萄糖醌H2O葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电极葡萄糖酶电极结构示意图 l葡萄糖

47、酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。 脲电极Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3一些常见的酶电极一些常见的酶电极底 物酶电 极5腺苷酸5腺苷酸脱氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脱氢酶Pt过氧化物过氧化氢酶Pt (O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt (O2)D-氨基酸D氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt (H2O2)琥珀酸琥珀酸脱氢酶Pt (O2)硫酸酯芳基硫酸酯酶Pt硫氰酸硫氰酸酶CN硝酸盐硝酸盐还原酶/ 亚硝酸盐还原酶NH4+亚硝酸盐亚硝酸盐还原酶NH3（气体）草酸草酸脱羧酶CO2（气体）青霉素青霉素酶pH乳酸乳酸脱氢酶；细胞色素bPt，Fe（CN）-4L氨基酸脱羧酶CO2L精氨酸精氨酸酶NH4+L天冬酰胺天冬酰胺酶NH4+柱式酶反应器工作原理示